摘要
大豆寡糖是大豆中的一类低聚糖，因其对热稳定，在豆粕中仍然存在，通常认为是畜禽饲料中的抗营养因子。迄今为止，大豆寡糖在猪上的抗营养作用研究较少，其作用机制更不清楚。本文旨在研究并揭示大豆寡糖及其组分对猪生长和采食调控的影响规律及其肠道微生物介导机制，为深入认识大豆寡糖的营养生理作用、开发采食调控技术提供依据。本文共包括五个试验。 试验一 饲粮添加不同水平大豆寡糖对仔猪生长性能和肠道微生物的影响 试验选用遗传背景和体重相近（12.78 ± 0.16 kg）的健康DLY 生长猪 80 头，试验猪只随机分为5个处理，每个处理8个重复，每个重复2头猪。分别饲喂玉米-豆粕型饲粮（对照组）与分别添加0%、1%、2%和3%大豆寡糖的玉米-大豆分离蛋白型饲粮。试验期共28天。结果发现： （1）与对照组相比，2%和 3%的大豆寡糖添加减低猪的平均日采食量和平均日增重（P ＜ 0.05），降低饲粮干物质、粗蛋白和能量的消化率（P ＜ 0.05），降低猪血清 GH、IGF-1 和 NPY 的含量（P ＜ 0.05）及下丘脑 NPY 和 AgRP 的 mRNA 相对表达量（P ＜ 0.05）；3%的大豆寡糖显著提高 F/G（P ＜ 0.05）。与对照组相比，0%寡糖组降低猪的平均日增重（P ＜ 0.05），大豆寡糖添加组降低猪的平均日采食量和平均日增重（P ＜ 0.05），显著提高猪的 F/G（P ＜ 0.05）。 （2）与0%寡糖组相比，大豆寡糖的添加提高猪盲肠食糜微生物中厚壁菌门的丰度，降低拟杆菌门的丰度（P ＜ 0.05），降低拟普雷沃菌（Alloprevotella）、普氏菌属（Prevo tella）、埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）和乳杆菌（Lactobacillus）的丰度（P ＜ 0.05）。与 0%寡糖组比较，大豆寡糖的添加显著提高盲肠中乙酸和丙酸的浓度，提高下丘脑中丙酸和丁酸的浓度（P ＜ 0.05），显著提高了盲肠GPR41 和GPR43，以及下丘脑GPR41 的 mRNA 相对表达量（P ＜ 0.05）。 以上结果表明，玉米-大豆分离蛋白无大豆寡糖饲粮的饲喂效果不如玉米-豆粕型饲粮；在玉米-大豆分离蛋白饲粮中，随大豆寡糖添加量的增加，猪的采食量、日增重及养分消化率下降，其作用与盲肠微生物及其代谢产物短链脂肪酸以及采食调控激素与基因表达量变化有关。 试验二 饲粮添加水苏糖和棉子糖对生长猪生长性能、养分消化率和血清激素的影响 试验一发现，大豆寡糖能够显著影响猪的生长性能，本试验旨在进一步探讨大豆寡糖的主要组成成分水苏糖和棉子糖对猪的影响。试验选用遗传背景和体重相近（21.41 ± 0.43 kg）的健康 DLY 生长猪 50 头，随机分为 5 个处理，每个处理 5 个重复，每个重复2头猪。分别饲喂玉米-豆粕基础饲粮（对照组，水苏糖加棉子糖含量约为0.09%），以及基础饲粮添加1%和3%水苏糖、0.2%和0.5%棉子糖。试验期共21天。结果发现： （1）与对照组相比，饲粮添加0.2%和0.5%棉子糖均显著降低猪的平均日采食量和日增重，降低饲粮干物质、粗蛋白、粗脂肪和能量的消化率（P ＜ 0.05），0.5%棉子糖增加猪的 F/G（P ＜ 0.05）；1%和 3%水苏糖组对生长性能无显著影响，3%水苏糖降低饲粮干物质、粗蛋白和能量的消化率（P ＜ 0.05）。 （2）与对照组相比，0.5%棉子糖组降低猪血清 NPY 含量（P ＜ 0.05），对其他激素无显著影响，而水苏糖组对测定激素均无显著影响。 以上结果说明，大豆寡糖中棉子糖显著降低了猪的生长性能和养分消化率，降低采食调控激素 NPY 水平，而水苏糖则仅降低了猪的部分养分消化率，表明大豆寡糖中起作用的主要组分可能是棉子糖。 试验三 饲粮添加棉子糖对生长猪采食的影响及机制 试验二的结果发现棉子糖对于生长猪生长性能和养分消化率的影响比水苏糖更大，本试验旨在进一步探究棉子糖对猪采食和肠道微生物的影响及可能机制。试验选取 24头遗传背景和体重相近（38.41 ± 0.45 kg）的 DLY 生长猪，随机分为 3 个处理，每个处理8个重复，每个重复1头猪。分为对照组（玉米-豆粕型饲粮）、0.5%棉子糖组和采食配对组（饲喂基础饲粮，饲喂量与棉子糖组一致）。试验期共13天。结果发现： （1）与对照组相比，0.5%棉子糖组降低生长猪的平均日采食量、日增重并增加 F/G（P ＜ 0.05）；同采食配对组相比，0.5%棉子糖组降低猪的平均日增重并提高了 F/G （P ＜ 0.05）。 （2）与对照组和采食配对组相比，0.5%棉子糖组降低生长猪对干物质、粗蛋白、粗脂肪和能量消化率（P ＜ 0.05），同时降低十二指肠淀粉酶和空肠脂肪酶的活性（P ＜ 0.05）。 （3）与对照组相比，棉子糖组降低血清GH、NPY的激素水平，增加PYY和GLP-1 的激素水平（P ＜ 0.05）；降低下丘脑 AgRP 的 mRNA 和蛋白表达量，增强了 POMC的mRNA和蛋白表达量，同时增加了PYY受体和GLP-1受体的mRNA表达量，降低了下丘脑AMPK-α蛋白的磷酸化程度（P ＜ 0.05）。 （4）与对照组相比，添加棉子糖增加盲肠微生物厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的丰度，减少拟杆菌门（Bacteroidetes）和螺旋体门（Spirochaetes）的丰度（P ＜ 0.05）；在属水平上，增加乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifido 微生物 α-和 β-多样性，增加微生物群的发酵和化学异养能力（P ＜ 0.05）。结肠微生物检测结果发现，在门水平上，棉子糖没有改变主要门的丰度；在属和种水平上，棉子糖降低了一种瘤胃球菌（unidentified_Ruminococcaceae）和升高了厌氧菌（Anaerovibrio）的丰度（P ＜ 0.05）；棉子糖增加了β-多样性（P ＜ 0.05），但对α-多样性没有影响。 （5）与对照组相比，棉子糖增加了盲肠中的乙酸、丙酸和丁酸浓度，结肠中丁酸的浓度，以及血清和下丘脑中的丙酸的浓度（P ＜ 0.05）；同时，棉子糖的添加提高了盲肠GPR41 和GPR43的mRNA和蛋白表达量以及下丘脑GPR41的 mRNA和蛋白表达量（P ＜ 0.05）。相关分析发现，棉子糖组盲肠和结肠短链脂肪酸的增加与其微生物群落和特定菌属的改变高度相关。 以上结果表明，棉子糖可改变后肠微生物组成，增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度，增加短链脂肪酸产量，一方面调节肠源性采食调控激素PYY，GLP-1分泌，另一方面抑制下丘脑AgRP神经元表达，促进POMC神经元表达，共同作用降低采食量。 试验四 短链脂肪酸对下丘脑采食神经元细胞的影响及相关机制 试验一和试验三发现微生物代谢产物短链脂肪酸可能参与到大豆寡糖及其组分棉子糖调控采食的过程中，本试验旨在利用小鼠采食神经细胞 N38 考察短链脂肪酸对下丘脑细胞采食信号的可能调控作用及机制，共有四项研究内容。 （1）分别研究不同水平的乙酸、丙酸和丁酸对N38细胞采食调节信号表达的影响，按设计的浓度梯度处理细胞24h。结果发现，仅有0.5mM的丙酸降低了促采食神经蛋白AgRP 的 mRNA 和蛋白表达（P ＜ 0.05），其它短链脂肪酸对 AgRP 的表达无显著影响； （2）进一步研究丙酸对AgRP的影响是否与细胞糖代谢有关。结果发现：24h处理后，丙酸组细胞培养液中葡萄糖浓度显著低于对照组，培养基中葡萄糖消耗量显著高于对照组，而细胞中葡萄糖浓度也显著低于对照组；添加丙酸提高了糖酵解关键酶 PKM的 mRNA 丰度且显著抑制了细胞 AMPK-α 的磷酸化（P ＜ 0.05），但对细胞糖原含量无显著影响，对细胞糖异生相关基因FOXO1，PEPCK1和PC的mRNA表达量也无显著影响。 （3）进一步探究了AMPK-α信号在丙酸抑制N38细胞AgRP表达中的作用。结果发现，AMPK激活剂的添加显著逆转了丙酸对AMPK-α磷酸化以及AgRP的mRNA和蛋白表达量的抑制作用（P ＜ 0.05）。 （4）进一步探究了短链脂肪酸受体GPR41在丙酸抑制N38细胞AgRP表达中的作用。结果发现：在丙酸处理中添加GPR41-siRNA可以显著降低GPR41的mRNA和蛋白表达量，提高细胞的 AgRP 表达和 AMPK-α磷酸化程度（P ＜ 0.05）。 以上结果说明，短链脂肪酸中丙酸具有调节下丘脑采食神经信号表达的作用，丙酸抑制AgRP表达与GPR41/AMPK信号通路有关。 试验五 高脂饲粮添加棉子糖对生长猪生长性能和肝脏脂质代谢的影响及机制 试验三和试验四发现棉子糖可通过改变肠道微生物和短链脂肪酸产量降低猪的采食和养分消化率，推测棉子糖在控制采食或养分摄入量方面具有应用价值。本试验旨在以高脂饲粮为模型，研究棉子糖通过降低采食量来缓解高脂作用的效果。试验采用双因子试验设计，选取 40 头遗传背景相同和体重相近（45.03 ± 1.84 kg）的 DLY 生长猪，随机分为4个处理，即对照组、0.5%棉子糖组，高脂组和添加0.5%棉子糖高脂组，每个处理10个重复，每个重复1头猪，试验期28d。结果发现： （1）高脂饲粮显著降低生长猪的日采食量，提高日增重，降低 F/G（P ＜ 0.05），改善饲粮粗蛋白、粗脂肪、干物质和能量消化率（P ＜ 0.05），增加血清甘油三酯的含量，提高肝脏脂质代谢相关基因 FAS 的 mRNA 表达量（P ＜ 0.05）。 （2）饲粮添加棉子糖可降低生长猪的日采食量，降低日增重（P ＜ 0.05），降低饲粮粗脂肪和能量消化率（P ＜ 0.05），降低血清甘油三酯的含量；降低血清 GH 和 NPY 的含量，提高 PYY 的含量（P ＜ 0.05），降低下丘脑 NPY 的 mRNA 表达量，增加 POMC 和GLP-1r 的 mRNA 表达量（P ＜ 0.05）；降低肝脏 FAS、ACC 的 mRNA 相关表达量，增加了 LPL 的 mRNA 相关表达量（P ＜ 0.05）。 （3）高脂饲粮和添加棉子糖均降低了生长猪盲肠食糜微生物中放线菌门（Actinobacteriota）的丰度（P ＜ 0.05）；高脂饲粮降低盲肠食糜微生物中杜氏乳杆菌属（ Dubosiella ）、消化球菌属（ Peptococcus ）、Subdoligranulum 和普拉梭菌（Faecalibacterium），增加考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）（P ＜ 0.05）；棉子糖可以增加罗氏菌属（Roseburia）、乳杆菌（Lactobacillus）、埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）和普雷沃氏菌属 UCG003（Prevotellaceae_UCG-003）的丰度（P ＜ 0.05）；高脂饲粮和棉子糖的添加都增加了生长猪盲肠中丙酸和丁酸的浓度，提高血清中乙酸和丙酸的浓度和下丘脑中丙酸的浓度（P ＜ 0.05）。 以上结果表明，高脂饲粮可促进猪的生长和肝脏脂肪沉积，棉子糖可通过降低猪的采食以及养分消化率降低高脂饲粮导致的生长促进和肝脏脂肪沉积，其作用与肠道微生物及其代谢产物改变有关。 通过上述系列研究表明，饲粮添加大豆寡糖可降低猪的采食量和生长性能，降低养分消化率，改变了猪肠道微生物组成并增加短链脂肪酸生成量；发挥作用的组分主要是棉子糖；棉子糖可改变盲肠微生物组成，增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度，增加短链脂肪酸产量，一方面调节肠源性采食调控激素PYY，GLP-1分泌，另一方面抑制下丘脑AgRP神经元表达，促进POMC神经元表达，共同作用降低采食量；其中，丙酸抑制AgRP表达与GPR41/AMPK 信号通路有关；棉子糖可通过降低猪的采食量和养分消化率来缓解高脂饲粮导致的增重和肝脏脂肪沉积效应。
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