摘要
背景： 肺癌是全世界癌症相关死亡的一个主要原因，其中小细胞肺癌（SCLC）是肺癌中恶性程度最高、侵袭性最强的亚型，以顺铂（Cispaltin-CDDP）为基础的化疗方案仍是广泛期小细胞肺癌的一线标准治疗方案，尽管初始有效率高，但患者很快出现耐药并且病情进展。铂类耐药已成为小细胞肺癌患者治疗的主要障碍。为了提高SCLC的铂类药物敏感性，以找到新的分子靶点，本研究通过构建小细胞肺癌顺铂耐药细胞，采用蛋白组学和转录组学相结合的综合策略,探索小细胞肺癌顺铂耐药的机制。 方法： 1.以顺铂敏感的亲代小细胞肺癌细胞系H446及在采用顺铂诱导亲代细胞建立的耐药细胞株H446-DDP为研究对象。通过大剂量冲击及药物浓度递增的方法构建耐药细胞株H446-DDP，采用CCK8法检测各细胞株对顺铂敏感程度。 2.将 H446 与 H446-DDP 进行 DIA 蛋白定量检测。在 UniProt/SwissProt （ http://www.uniprot.org ）人类蛋白质组数据库上搜索质谱数据，用Proteome Discoverer 2.1.0182（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA）进行蛋白质检索分析。使用mapDIA软件对H446和H446-DDP进行蛋白质差异表达分析，通过Gene Ontology数据库对差异蛋白质进行了GO富集分析，使用KOBAS（2.0）进行Pathway富集分析，应用STRING蛋白质互作数据库（http://string-db.org/）对核心差异蛋白绘制蛋白的网络互作图。 3.利用 Illumina 二代高通量测序平台(HiSeqTM2500/4000)对 H446 与H446-DDP进行测序，通过STAR（v2.5.2b）软件与参考基因组（ensembl数据库人基因组）比对，使用 DESeq (1.10.1)（Anders et al., 2010）对H446和H446-DDP两组数据进行差异表达分析，通过GO和Pathway富集分析，对核心蛋白绘制蛋 白的网络互作图。 4.在蛋白质组学和转录组学的基础上，将差异表达基因和蛋白质进行整合分析和关联研究，根据两组数据的差异表达趋势，寻找两个组学中的核心差异蛋白。 结果： 1. 本研究通过顺铂（CDDP）大剂量冲击和剂量逐步递增的方法，成功构建了人源性小细胞肺癌顺铂耐药细胞株H446-DDP，其顺铂IC50为0.131mM，为原代细胞株的8.8倍。 2. 通过DIA检测，从2组细胞中分别鉴定到了2263个蛋白，筛选出211种差异蛋白质，其中193个蛋白上调和18个蛋白下调。根据GO和KEGG分析结果，细胞的增殖与复制主要与核糖体上调有关，参与细胞的DNA修复，细胞识别所涉及的蛋白质定位和结合上调，下调的蛋白与细胞的免疫调节和凋亡有关，免疫微环境和细胞凋亡的负性调控也与细胞逐渐产生顺铂耐药有关。将已经筛选出的差异蛋白质通过STRING数据库进行蛋白互作用网络分析，核糖体途径和代谢途径中的核心蛋白主要有ATP O（ATP synthase subunit O，三磷酸腺苷合成酶O）、PBGD（Porphobilinogen deaminase，胆红素原脱氨酶）、APRT （ Adenine phosphoribosyltransferase ，腺嘌呤磷酸核糖转移酶）、NADH （ Nicotinamide adenine dinucleotide ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、ACAT1 （acetyl-CoA acetyltransferase ，乙酰辅酶A乙酰转移酶1），这5个蛋白很有可能成为小细胞肺癌顺铂耐药的治疗靶点。 3. 二代高通量测序共鉴定出 8508 个差异基因，其中上调基因4190个，下调基因4318个。根据GO和KEGG分析差异基因主要与蛋白的结合和RNA的结合有关，主要富集在细胞自噬有关的通路，对细胞自噬通路中表达的差异基因在STRING数据库中比对，在已知的蛋白互作关系网络中找到核心蛋白。在108个富集在细胞自噬通路的上调基因中，共比对出6个有意义的蛋白，分别是MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1，丝裂原活化蛋白激酶1）、RAF1（RAF family protein 1，RAF家族蛋白1）、STX17（Syntaxin 17，合成酶17）、RB1CC1（RB1-inducible coiled-coil 1，Rb1诱导的卷曲螺旋1）、TSC2（Tuberous sclerosis complex 2，结节硬化症复合体2）、ATG14（autophagy-related gene 14，自噬相关基因14），在小细胞肺癌顺铂耐药过程中，细胞自噬发挥着重要作用。 4. 利用转录组数据来建立蛋白搜索数据库，共找到的78个差异蛋白，其中2个为新转录本数据，暂无对应的蛋白，其他76个均为已知功能蛋白。通过KEGG进行Pathway 通路分析，富集程度最高的为核糖体通路，在78个差异蛋白中有19个蛋白富集在核糖体通路，均在H446-DDP耐药细胞中表达上调，然而其对应的差异基因均为下调，均为不同亚基的核糖体蛋白。共有29个差异基因与其相应的蛋白共同表达上调，其中2个为新转录本，27个为已知的基因，其中SLC27A6（Solute carrier family 27 member 6，柠檬酸盐质膜载体）基因的log2FoldChange为13.069，根据差异基因分析显示其在原代细胞中不表达，是耐药细胞特异性表达的基因，在蛋白组数据中，SLC27A6蛋白的log2FC为3.62。同时ISOC1（Isochorismatase domain-containing protein 1，异丝裂解酶结构域蛋白1）、IL13RA2（Interleukin-13 receptor subunit alpha-2，白细胞介素13受体亚单位α-2）、TPBG（Trophoblast glycoprotein，滋养层糖蛋白）、S100A10（Calpactin Ⅰ light chain，钙蛋白Ⅰ轻链）在转录组及蛋白组均显著上调，这些蛋白可能成为顺铂耐药的小细胞肺癌逆转耐药的靶点。 结论： 1. 本研究通过顺铂（CDDP）大剂量冲击和剂量逐步递增诱导的方法，构建了人源性小细胞肺癌顺铂耐药细胞株H446-DDP。通过DIA质谱检测和信息分析，差异蛋白高度富集于核糖体途径和代谢途径中，其中核心蛋白主要有ATP O、NADH、ACTH1、APRT、PBGD。 2. 通过转录组学分析差异基因主要富集在细胞自噬有关的通路，在108个富集在细胞自噬通路的上调基因中，共筛选出6个有意义的基因，分别是MAPK1、RAF1、STX17、RB1CC1、TSC2、ATG14。 3. 利用转录组数据来建立蛋白搜索数据库，对差异表达蛋白和与之相对应的差异基因的转录本进行比较分析，结果表明两者的相关性较差，提示从基因到功能蛋白的转录过程中，翻译和翻译后的调控对蛋白质的表达具有非常重要的调控作用。通过联合分析进一步发现富集程度最高的为核糖体途径，SLC27A6、ISOC1、IL13RA2、TPBG、S100A10可能成为顺铂耐药的小细胞肺癌提高顺铂药物敏感性的靶点。
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