摘要
粘质沙雷氏菌Serratia marcescens是一种条件性致病细菌，广泛存在于自然环境中，已有研究表明昆虫感染粘质沙雷氏菌会造成不同程度的死亡。本研究发现环境中的粘质沙雷氏菌可以造成尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis大量死亡，但是目前，关于白蚁感染粘质沙雷氏菌致死的机理尚不清楚。为了探究粘质沙雷氏菌对白蚁的感染机理，本研究以尖唇散白蚁为研究对象，首先将从野外采集的尖唇散白蚁巢群在实验室培养，对死亡白蚁体内出现的红色细菌进行了分离、纯化；通过16SrDNA序列测定进行鉴定；通过纯化后的粘质沙雷氏菌对尖唇散白蚁巢中的木屑感染实验，研究白蚁的感染性状以及巢群数量变化；将巢中染菌2天存活的尖唇散白蚁工蚁（WS1）、染菌15天存活的尖唇散白蚁工蚁（WS2）、巢中不染菌的2天（W1）和15天（W2）的工蚁进行转录组测序分析，筛选尖唇散白蚁感染粘质沙雷氏菌的致病相关基因，探讨该细菌对白蚁巢群的影响和致病机制。本研究得到的主要结果和结论包括： 1. 对死亡白蚁体内出现的红色细菌进行了分离、纯化和鉴定，确定该菌为粘质沙雷氏菌；并且阐明了粘质沙雷氏菌对白蚁的致死行为变化，以及蚁群死亡的数量动态变化。我们发现从野外采集的尖唇散白蚁在实验室培养过程中，大量个体死亡并且出现了身体变红的现象。通过对该菌分离、纯化和16SrDNA序列测定进行鉴定，确定该菌为粘质沙雷氏菌。将纯化后的粘质沙雷氏菌感染白蚁巢中的木屑，与巢中不染菌的白蚁进行对照，发现巢中白蚁在染菌12 h开始出现了死亡变红的现象；到24 h巢中白蚁死亡数量为17±3；1-6天内白蚁群体的死亡数在55±3只，死亡率达52%-58%。7天以后白蚁死亡数量减少（每天0-1只）；在感染2周后巢中白蚁几乎没有死亡；而巢中不染菌的白蚁两周后的存活率约95%。染菌的白蚁在死亡之前，四肢抽搐，不能正常行动，最后只有触角小幅度动，但身体都没有变红；白蚁群体刚开始死亡时，头部和触角先变红，随着染菌时间变长，白蚁全身变红，最后腐烂看不见其形态；而巢中不染菌的白蚁群体，虽然有个别死亡的白蚁，但是死亡个体的身体不会出现红色现象。 2. 由于巢中染菌2天的巢群白蚁死亡数量最多，以及染菌15天的巢群几乎不发生个体死亡，本研究将巢中染菌2天和15天的工蚁与巢中不染菌2天和15天的工蚁进行转录组测序。染菌与不染菌的尖唇散白蚁工蚁转录组通过BLASTX程序与四大数据库（Nr、Swissprot、KEGG、KOG）进行比对，其共注释到了109,909个Unigene，其中Nr注释的Unigene有34,120个、Swissprot注释的Unigene有15,968个、KEGG注释的Unigene有27,796个、KOG注释的Unigene有14,832个。此次转录组测序首次完成了尖唇散白蚁工蚁感染粘质沙雷氏菌的数据库的建立，为研究粘质沙雷氏菌对尖唇散白蚁致病的分子机制提供了宝贵的基因数据库资源。 3. 使用DESeq2软件分析对样本的差异表达基因进行了筛选，结果表明，未染菌2天工蚁（W1）和感染粘质沙雷氏菌2天的工蚁（WS1）的差异表达基因有132个，其中与W1相比在WS1中表达水平发生上调的基因有105个，下调的基因有27个。我们对筛选出来的基因进行了KEGG富集分析和功能注释，其中差异表达基因显著富集的通路有 14 个，分别为细胞凋亡通路（ Apoptisis pathway)、肌萎缩侧索硬化症通路（Amyotrophic lateral sclerosis pathway）、自噬通路（Phagosome pathway）、NOD-like受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway ）、帕金森病通路（Prion disease pathway）、抗原处理和呈递通路（Antigen processing and presentation pathway）、神经退行性变-多种疾病通路（Neurodegeneration-multiple diseases pathway）等。显著性差异基因在GO分类中的分子功能分类中包括了催化活性（catalytic activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、焦磷酸酶活性（pyrophosphatase activity）等；在生物学过程中包含了小分子代谢过程（ small molecule metabolic process)、碳水化合物代谢过程（carbohydrate metabolic process）、单糖代谢过程（monosaccharide metabolic process）等；在细胞组成中包括了细胞质膜（plasma membrane）、线粒体内膜蛋白复合物（inner mitochondrial membrane protein complex ）、线粒体蛋白的复合物（ mitochondrial protein-containing complex）等。通过对富集通路中差异基因表达水平的分析，揭示白蚁感染粘质沙雷氏菌的基因调控机理。 4. 对神经退行性变-多种疾病通路的差异基因的测序结果使用qRT-PCR对其进行表达水平分析，比较了11个神经退行性变-多种疾病通路的差异基因在巢中感染粘质沙雷氏菌的工蚁（2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天）和巢中不染菌工蚁的表达水平。结果显示，差异基因的表达水平与不染菌相比均有所变化，其中11个差异基因中的表达水平其在感染粘质沙雷氏菌工蚁中都低于未染菌的有2个基因分别为tuba1a（Unigene0107104）和vcp（Unigene0040734）；有9个基因的表达水平在感染粘质沙雷氏菌后都发生了上调，其中6个基因其在染菌第2天的表达水平是最高的，分别为：prkca（Unigene0084045）、tuba3（Unigene0102762）、tubb（Unigene0003912）、tubb（Unigene0004027）、pfn1（Unigene0015455）和act10（nigene0003584）。 5. 通过对qRT-PCR分析比较9个细胞凋亡通路中的差异基因：3个组织蛋白酶（CTSB）相关基因，2个肌动蛋白（ACTB）相关基因，4个微管蛋白（TUBA）相关基因在巢中没有感染粘质沙雷氏菌工蚁和感染粘质沙雷氏菌2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天的工蚁中的表达水平。结果显示，巢中感染粘质沙雷氏菌的白蚁的细胞凋亡通路中的差异基因表达水平与不染菌相比均有所变化。其中9个差异基因中与不染菌工蚁相比，感染粘质沙雷氏菌后其表达水平发生上调的基因有8个，其中有5 个差异基因的表达水平在感染粘质沙雷氏菌第 2 天是最高的分别为：tuba3 （ Unigene0102762 ）、tubb （ Unigene0003912 ）、tubb （ Unigene0004027 ）、act10 （nigene0003584）、cp3（Unigene0079525）；感染粘质沙雷氏菌后其表达水平均发生下调的基因有1个tuba1a（Unigene0107104）。 综上所述，本研究首次从尖唇散白蚁中分离、纯化和鉴定出了粘质沙雷氏菌；通过将巢中木屑染菌的方式对巢群白蚁的数量及感染性状特征进行分析研究；对感染粘质沙雷氏菌的尖唇散白蚁进行了转录组测序，测序分析了感染粘质沙雷氏菌2天工蚁、染菌15天的工蚁与不染菌2天工蚁、不染菌15天工蚁转录组数据；分析比较了神经退行性变-多种疾病通路和细胞凋亡通路的差异基因在不染菌与感染粘质沙雷氏菌（2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天）工蚁的表达水平。这些研究揭示了尖唇散白蚁感染粘质沙雷氏菌致病的原因与细胞凋亡和神经退行性疾病有关，为尖唇散白蚁感染粘质沙雷氏菌的致病机制提供了科学依据，同时为白蚁的防治提供了新思路。
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