摘要
莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）既是一种重要的水生经济作物，也是一种重要的水生园艺植物，而且具有极大的食用、以及观赏和药用价值。莲的开花生热现象是指莲在开花时能自主产热，使得花室温度高于周围环境温度,这对莲的生殖成功具有重要的生物学意义。有研究表明，在开花生热过程中大量基因的表达发生了快速变化，这跟非编码 RNA 参与调控有关。然而，在全基因组水平探究莲开花生热的分子基础以及非编码 RNA 参与的调控机制尚未见报道。本研究以莲 5个连续发育时期的花托组织为材料，通过small RNA 测序以及链特异性文库测序技术，在全基因组水平鉴定了莲花托中的miRNA和lncRNA，并利用生物信息学方法，对鉴定到的这些非编码 RNA 进行了表达模式及功能的分析，以期揭示miRNA和lncRNA在莲开花生热过程中的调控作用。 本研究的主要结果如下： 1. 对莲 5 个不同发育时期的花托样品进行 small RNA 文库测序分析，鉴定得到 172 个已知 miRNA 和 126 个新的 miRNA。大约 81％的已知 miRNA 不存在时期特异性表达模式。在各个发育时期之间鉴定到了 138 个差异表达 miRNA （differentially expressed miRNAs, DEMs）。同时，利用时间序列聚类分析，一共筛选到了 29 个跟开花生热相关的 miRNA,他们包含在 cluster 7 和 cluster 8 中且其表达模式跟温度变化趋势有明显的相关性。随机筛选了9个DEM进行qRT-PCR实验验证其表达模式，实验结果跟测序结果基本符合，说明测序数据具有可靠性。 2. 对开花生热相关的 miRNA 进行靶标预测及功能分析。结果表明，cluster 7中预测得到17个DEM的350个靶基因，这些基因跟泛醌和其他萜类-醌的生物合成途径、核黄素代谢途径有关；cluster 8 中预测得到了 12 个 DEM 的 352 个靶标基因，这些基因跟氧化磷酸化过程有关。将转录组测序数据与小 RNA 测序数据整合分析，结果表明 miR156_2，miR395a-5，miR481d 以及 miR319p 可能通过调控细胞呼吸相关基因从而参与开花生热过程。 3. 通过对莲花托5个不同发育时期进行链特异性文库测序，共鉴定出lncRNA 22,693个。其中，有10,162（大约44.78%)个lncRNA存在时期特异性表达模式。且 stage 5 含有特异表达 lncRNA 的数量最多，stage 3 含有特异表达 lncRNA 的数量最少，它们分别是1084和435个。在各对照组的差异表达lncRNA （differentially expressed lncRNAs, DELs）中，下调表达的 lncRNA 数量远多于上调表达 lncRNA的数量。同时，随机选择了12个DELs进行qRT-PCR实验来验证其表达模式，实验结果与测序结果基本符合。 4. 对链特异性文库测序鉴定到的转录本进行加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA），共鉴定到了两个跟开花生热密切相关的共表达模块。其中，MEpurple模块包含20个lncRNA和67个mRNA，GO富集分析表明该模块中的基因跟硫酸盐吸收有关；MEpink模块包含25个lncRNA和72个mRNA, GO富集分析表明该模块中的基因跟线粒体电子传递链有关。同时，在本研究中还预测到了70个lncRNA可以作为29个miRNA的伪靶标，参与调控16个跟开花生热相关的基因。然后，我们利用双荧光素酶报告基因实验验证了 LT_00068702-miR164a_4-NNU_11990 之间的互作关系，并通过过表达LT_00068702和LT_00058942，在转基因拟南芥植株中表现出了开花提前的表型。 本研究利用高通量测序技术，获得了莲花托发育过程中的 miRNA 表达谱和lncRNA表达谱。通过对这些非编码RNA的表达模式进行分析，筛选出了跟开花生热密切相关的lncRNAs和miRNAs。功能分析表明，这些非编码RNA可以通过不同的作用方式调控细胞呼吸和能量代谢相关的基因从而参与开花生热过程。这些结果加深了我们对非编码 RNA 参与的开花生热调控机制的理解，为进一步揭示植物开花生热的分子基础累积了资料。
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