摘要
第一部分：外侧缰核T型钙通道参与神经病理性疼痛-抑郁共病的机制研究 目的：神经病理性疼痛（Neuropathic pain，NP）作为临床中常见但治疗难度大的疾病，因其疼痛程度剧烈以及症状反复发作等特点可导致部分患者出现相关抑郁的表现。抑郁的发生也会导致患者疼痛程度加重，形成“疼痛-抑郁”恶性循环。目前NP-抑郁共病已引起广泛的关注，但关于NP-抑郁共病的中枢机制仍未明确。外侧缰核（lateral habenula，LHb）是位于丘脑的神经核团之一，其神经元兴奋性与疼痛以及负性情绪密切相关，因此LHb被认为是调控疼痛以及负性情绪的关键脑区。T型钙通道作为钙离子通道家族中的一员，可参与神经元兴奋性的调节，其异常的表达以及功能上的变化则会导致疼痛以及负性情绪的产生。那么LHb中的T型钙通道是否参与到NP-抑郁共病的调节中呢？我们以此为科学问题进行了第一部分的研究，使用坐骨神经挤压模型（sciatic nerve crush， SNC）作为NP模型，明确SNC模型在NP-抑郁共病中LHb内神经元的T型钙通道的作用机制。 方法：选取 C57BL/6J 野生型小鼠（雄性，体重 20 - 30 g）建立 SNC 以及Sham 模型小鼠，分别于术前及术后（1、3、5 d 及 1 - 10 w）进行机械痛阈的测定，于术后6 w、8 w 以及 10 w 进行抑郁以及运动相关行为学的测定，明确 SNC模型NP-抑郁共病出现时间。于两组小鼠术后 8 w 时进行离体电生理实验，观察LHb神经元兴奋性以及T型钙通道的功能变化。使用脑立体定位注射技术于LHb处注射 AAV-CAMKⅡα-EGFP 以及 AAV-mDLX-mcherry 两种病毒标记谷氨酸能神经元以及GABA能神经元，使用免疫荧光组织化学染色明确LHb神经元T型钙通道各个亚型在 LHb内与谷氨酸能神经元的表达情况。使用 Mibefradil 观察离体电生理中LHb神经元兴奋性以及T型钙通道的功能变化，同时观察颅内置管后于LHb处局部给予Mibefradil后两组小鼠痛、抑郁以及运动行为学的变化。 结果：（1）SNC 模型于术后 3 d 出现痛觉过敏并可维持至术后 10 w，于术后8 w 出现抑郁样行为并且在术后 10 w 疼痛消失后抑郁样行为仍存在，SNC 模型并不会影响其运动功能。 （2）SNC小鼠与Sham组小鼠相比在NP-抑郁共病状态下主动放电根数增加以及在自发放电中Burst放电频率增加，神经元兴奋性增加。 （3）LHb内主要为谷氨酸能神经元并且谷氨酸能神经元上表达T型钙通道主要以Cav 3.1、Cav 3.3 为主。 （4）SNC小鼠与Sham组小鼠相比在NP-抑郁共病状态下T型钙电流IT振幅以及电流密度显著增加。 （5）Mibefradil可显著降低LHb神经元兴奋性以及IT的振幅以及电流密度。 （6）LHb局部给予Mibefradil后SNC组小鼠的机械痛敏以及抑郁样行为可得到显著缓解并对两组小鼠运动功能无影响。 结论：SNC模型可引起NP-抑郁共病的产生，LHb神经元T型钙通道是参与NP-抑郁共病的形成以及调控疼痛以及抑郁的离子通道，是NP-抑郁共病治疗的重要靶点。 第二部分：未定带-外侧缰核神经环路参与神经病理性疼痛-抑郁共病的机制研究 目的：LHb作为信息输入、整合以及输出的枢纽，可接受来自多个疼痛、情绪相关脑区的输入参与疼痛以及抑郁的调节。未定带（zona incerta，ZI）是主要含有γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）能神经元的脑区之一，近年来已有多篇研究证实了ZI在疼痛以及情绪功能障碍中的作用。另外，也有研究证明ZI是LHb的上游脑区，两者具有解剖学上的联系。既然ZI、LHb这两个脑区都参与疼痛以及情绪的调节并且二者之间具有突触连接，那么ZI-LHb这条神经环路是否在NP-抑郁共病中发挥作用呢？为了明确这个问题，我们进行了第二部分的研究，使用坐骨SNC模型作为NP模型，明确ZI-LHb神经环路在NP-抑郁共病中的作用机制。 方法：选取 C57BL/6J 野生型小鼠（雄性，体重 20 - 30 g）建立 SNC 以及Sham模型小鼠，使用离体膜片钳技术明确两组小鼠LHb微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic current，mIPSC）在 NP-抑郁共病的变化，使用脑立体定位注射技术注射 1%荧光金（Fluoro-Gold，FG）至 LHb，于1 w 后取材观察小鼠冠状位脑片，明确被 1% FG 标记的脑区，即 LHb 上游脑区。使用免疫荧光组织化学染色观察两组小鼠ZI脑区c-Fos的变化。使用脑立体定位注射技术注射AAV-hsyn-mcherry-Cre（AAV2/Retro）至LHb，于ZI处注射AAV-hsyn-DIO-hM3D(Gq)-mcherry（AAV2/9）于 3 w 后使用免疫荧光组织化学染色方法将脑片与anti-GABA以及anti-glutamate进行共染观察ZI投射至LHb处的神经元类型。使用脑立体定位注射技术注射AAV-hsyn-CRE（AAV2/Retro）至LHb，于ZI 处注射 AAV-EF1α-DIO-hCHR2(H134R)-mcherry（AAV2/9），3 w 后进行离体膜片钳记录 LHb 神经元 IPSC。使用脑立体定位注射技术注射 AAV-hsyn-CRE （AAV2/Retro）至 LHb，于 ZI 处注射 SNC：AAV-EF1α-DIO-hCHR2(H134R)-mcherry（AAV2/9），Sham：AAV-EF1α-DIO- eNpHR3.0-mcherry（AAV2/9），3 w后进行光遗传实验观察各组小鼠痛及抑郁行为学的变化。使用脑立体定位注射技术注射AAV-hsyn-mcherry-Cre（AAV2/Retro）至LHb，于ZI处注射SNC：AAV-hsyn-DIO-hM3D(Gq)-mcherry（AAV2/9），Sham：AAV-EF1α-DIO- hM4D(Gi)-mcherry（AAV2/9），3 w 后进行化学遗传实验观察各组小鼠痛及抑郁行为学的变化，取注射化学遗传相关病毒的小鼠腹腔注射 CNO 1.5 h 后进行取材并取脑片行免疫荧光组织化学染色，观察各组小鼠LHb脑区c-Fos的变化。 结果：（1）SNC小鼠与Sham组小鼠相比，在NP-抑郁共病的状态下mIPSC频率显著下降。 （2）LHb接受来自多个脑区的投射，包括ZI，LH，LPO以及mPFC等。SNC小鼠ZI脑区与Sham组小鼠ZI脑区相比在NP-抑郁共病状态下的c-Fos显著下降。 （3）ZI投射至LHb的神经元以GABA能神经元为主，LHb能接收到来自ZI脑区的GABA能信号。 （4）光激活ZI-LHb神经环路可显著缓解SNC小鼠机械痛敏及抑郁样行为，光抑制ZI-LHb神经环路可引起Sham组小鼠机械痛敏及抑郁样行为。 （5）化学遗传激活ZI-LHb神经环路可显著缓解SNC小鼠机械痛敏及抑郁样行为，化学遗传抑制ZI-LHb神经环路可引起Sham组小鼠机械痛敏及抑郁样行为。化学遗传激活ZI-LHb神经环路可引起SNC组小鼠LHb脑区c-Fos表达下降，化学遗传抑制ZI-LHb神经环路可引起Sham组小鼠LHb脑区c-Fos表达增加。 结论：ZI神经元轴突末梢可投射至LHb脑区，同时ZI-LHb神经环路参与疼痛以及抑郁样行为的调节，在NP-抑郁共病的调节中起着至关重要的作用。
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