摘要
肌少症是一种进行性、退行性全身性骨骼肌疾病，表现为骨骼肌肌量减少、强度下降、功能减退。流行病学，临床和实验室证据表明维生素D对肌肉功能具有明显的影响。血清维生素D水平降低与骨骼肌肌量减低、强度下降、肌少症发病率增加及跌倒风险增加均密切相关。我们最近利用 1,25(OH)2D3 缺乏[1α(OH)ase-/-]小鼠模型研究发现 1,25(OH)2D3缺乏可通过诱导氧化应激、骨骼肌细胞衰老和衰老相关分泌表型(SASP)，并通过抑制骨骼肌再生，导致肌少症的发生。然而，活性维生素D缺乏在肌少症发病中的作用机制尚有待进一步研究。我们课题组建立了Prx1-Sirt1转基因(Prx1-Sirt1Tg)小鼠, 即间充质干细胞(MSC)特异性过表达Sirt1的小鼠模型，并通过Prx1-Sirt1转基因小鼠与1α(OH)ase-/-小鼠杂交建立一个 MSC 过表达 Sirt1 的 1α(OH)ase-/- (Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-)小鼠，通过颌骨表型分析证明了 MSC 过表达 Sirt1 通过增加成骨细胞骨形成和减少破骨细胞骨吸收，显著改善了活性维生素D缺乏引起的颌骨疏松。鉴于骨骼肌中存在Prx1衍生的间充质祖细胞， 骨髓 MSCs(BM-MSCs)移植能促进骨骼肌组织再生，激活卫星细胞的肌源性分化，因此，本文提出研究MSC过表达Sirt1在预防活性维生素D缺乏致肌少症中的作用及机制。 我们利用 Western blot 检测发现 Sirt1 蛋白表达水平在 1α(OH)ase-/-小鼠骨骼肌组织明显下调，而在Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-小鼠骨骼肌组织明显上调；利用Real-time RT-PCR 检测发现1,25(OH)2D3上调Sirt1和Myod1 mRMA在C2C12 细胞中的表达；利用生物信息学、染色质免疫沉淀技术(ChIP)和荧光素酶双报告基因实验证明1,25(OH)2D3能够通过VDR介导转录上调Sirt1在成肌细胞中的表达。 为了明确MSC过表达Sirt1是否能够纠正活性维生素D缺乏引起的骨骼肌肌量减少、肌纤维萎缩和二型肌纤维减少，我们利用体重和胫骨前肌重量称量及它们之间比值计算、组织学和 Laminin、MyHC Ⅱ A 和 MyHC Ⅱ B 免疫荧光染色等方法比较分析了 2 月龄同窝 WT、1α(OH)ase-/-和 Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-雄鼠胫骨前肌的表型差异。结果证明骨骼肌肌量、骨骼肌横截面积和 MyHC Ⅱ A 和 MyHCⅡ B 阳性肌纤维数量在 1α(OH)ase-/-雄鼠均较 WT 雄鼠显著减少，而这些指标在Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-雄鼠均较1α(OH)ase-/-雄鼠明显增加。这些结果说明MSC过表达Sirt1能够通过纠正活性维生素D缺乏引起的骨骼肌肌量和二型肌纤维减少及肌纤维萎缩，而发挥改善活性维生素D缺失引起肌少症的作用。 为了明确MSC过表达Sirt1矫正活性维生素D缺乏引起的肌少症是否与抑制维生素D缺失引起的卫星细胞数量减少、骨骼肌细胞衰老和SASP有关，我们利用Pax7、p16、p21 和 p65 抗体进行免疫荧光染色、Western blot 等方法比较分析了 2 月龄同窝 WT、1α(OH)ase-/-和 Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-雄鼠胫骨前肌卫星细胞数量、细胞衰老和SASP的变化。结果证明：与WT雄鼠相比，Pax7阳性细胞百分率在1α(OH)ase-/-雄鼠显著减少，而p16、p21和p65阳性细胞百分率及p16、p21、p65和IL-1α蛋白表达水平在1α(OH)ase-/-雄鼠显著升高；与1α(OH)ase-/-小鼠相比，Pax7阳性细胞百分率在Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-小鼠显著增加，而上述细胞衰老和SASP指标在Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-雄鼠显著降低。这些结果说明MSC过表达Sirt1可能通过增加卫星细胞，抑制骨骼肌细胞衰老和SASP，发挥矫正活性维生素D缺失引起的肌少症作用。 为了明确 MSC 过表达 Sirt1 是否能够促进骨骼肌再生而加速骨骼肌损伤修复，我们通过注射BaCl2到2月龄WT和Sirt1Tg雄鼠右侧胫骨前肌，处理5天后取损伤的胫骨前肌，利用 HE 染色、免疫荧光染色、Western blot 等实验方法比较分析了小鼠骨骼肌损伤修复情况。结果显示：与WT+BaCl2雄鼠相比，新生肌纤维数、eMyHC+肌纤维面积和 BrdU 阳性细胞百分率和 Sirt1 蛋白表达水平在Sirt1Tg+BaCl2雄鼠均显著增加，而 p53，IL-6，p65 和 Mmp3 蛋白表达水平在Sirt1Tg+BaCl2雄鼠显著降低。这些结果说明MSC过表达Sirt1能够通过促进骨骼肌再生而加速骨骼肌损伤修复。 为了明确活性维生素 D 或白藜芦醇在抑制骨骼肌细胞衰老和 SASP 中的作用机制，我们使用白藜芦醇处理 C2C12 细胞，通过蛋白质免疫共沉淀分析发现白藜芦醇能增加Sirt1与p53和p65的结合而降低Acel-p53和Aceyl-p65的水平。为了明确活性维生素 D 或白藜芦醇是否能够抑制氧化应激引起的骨骼肌细胞衰老和SASP, 我们使用 H2O2单独处理或联合 10-8M 1,25(OH)2D3或 10 μM 白藜芦醇处理C2C12 细胞，利用 Western blot 方法检测细胞衰老和 SASP 相关分子表达水平的变化及细胞免疫荧光染色观察了Acel-p53和Aceyl-p65的亚细胞定位。结果发现H2O2能够明显上调p16、p53、p65、IL-1α和IL-6蛋白在C2C12细胞中的表达水平，而1,25(OH)2D3和白藜芦醇均能明显下调这些蛋白在C2C12细胞中的表达水平；在H2O2单独处理的C2C12细胞中，Acel-p53和Aceyl-p65主要定位在细胞核，而在 1,25(OH)2D3或白藜芦醇处理后， Acel-p53 和 Aceyl-p65 主要定位细胞质中。这些结果支持活性维生素D或白藜芦醇通过激活Sirt1降低p53和p65乙酰化水平抑制C2C12细胞衰老和SASP。 我们利用 Western blot 检测发现 Myod1 蛋白表达水平在 1α(OH)ase-/-小鼠骨骼肌组织明显下调，而在 Sirt1Tg/1α(OH)ase-/-小鼠骨骼肌组织明显上调。1,25(OH)2D3处理C2C12细胞能显著上调Myod1的mRNA转录表达水平。利用生物信息学分析发现在Myod1基因启动子区域存在一个VDRE样序列；利用染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验证明 1,25(OH)2D3能够通过 VDR介导转录上调Myod1基因在C2C12细胞中的表达。 本文研究结果说明活性维生素D缺乏通过VDR介导转录下调Sirt1和Myod1，增加 p53 和 p65 乙酰化水平，抑制骨骼肌前体细胞增殖和分化及骨骼肌细胞再生，增加骨骼肌细胞衰老和SASP，从而加速肌少症发生，而MSC过表达Sirt1能够预防活性维生素 D 缺乏引起的肌少症的发生。本研究不仅揭示活性维生素D 在防治肌少症中的分子机制，同时将为活性维生素 D 及其下游靶分子在防治肌少症中的临床应用提供实验和理论依据。
NETL