摘要
痛风（Gout）是由于嘌呤类物质在体内代谢紊乱，导致机体产生过量的尿酸或机体对尿酸的排泄减少，造成体内血尿酸浓度持续增高，最终导致尿酸盐结晶沉积在软组织处而引起的一种代谢性疾病。随着人民生活水平的不断提高，我国痛风发病率逐年上升，并呈年轻化趋势，现如今痛风已成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病。治疗痛风的主要方法是降低血清尿酸水平，黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XO）是体内将黄嘌呤和次黄嘌呤氧化形成尿酸的一种关键酶，因此抑制 XO 的活性，减少尿酸的生成量，是预防和治疗痛风的有效靶标之一。目前在临床使用的 XO 抑制剂主要包括别嘌醇和非布司他等药物，但是这些药物在临床应用中仍然存在超敏反应综合征、肾毒性和皮疹等不良反应。因此，进行新型 XO 抑制剂的研究显得尤为重要。我国中药材资源丰富，这些中药材中往往含有结构新颖的化合物，是新药发现的良好资源，而这无疑为新型抗痛风药物的研究提供了重要选择。基于此，本研究通过制备 261 种中药材水提取物，对其进行抗痛风药物的系统性筛选研究，以期为中药源抗痛风药物的研究提供基础研究资料，初步取得了如下研究结论： 1. XO 抑制剂筛选平台的搭建：采用 XO，以黄嘌呤为反应底物，别嘌醇为阳性对照，使用紫外分光光度计检测反应体系的吸光值变化，以判断待测物质对 XO 的抑制作用。通过对检测波长、酶浓度、底物浓度、检测时间、温度、有机试剂等因素的优化，最终建立了最佳的筛选方法为：底物浓度为 180 mg/L，酶浓度为 50 U/L，检测波长为 290 nm，温度为 30℃，反应时间为 300 s，PBS或 5%的二甲基亚砜和甲醇为样品溶剂。以别嘌醇为阳性对照评价平台稳定性（变异系数＜ 2%）的结果显示，本研究建立的方法稳定、可靠，能用于XO抑制剂的快速筛选。 2. 中药材 XO抑制活性的筛选评价：采用搭建的 XO抑制活性的筛选平台，通过沸水浴回流提取法对 156 种中药材进行制备并评价 XO 抑制活性。结果显示抑制率大于70%的中药材有 5 种，分别为毛细辛（87.99%）、芦荟（79.65%）、芫花（75.59%）、苏木（71.25%）和附子（71.18%），占比 3.21%；抑制率介于 60%~ 70%的有 5种中药材，分别为小伞虎耳草（ 69.53%）、檀香木（ 65.00%）、刺五加（ 63.16%）、凤尾草（63.16%）和连翘（61.62%），占比 3.21%；抑制率介于 50%~ 60%的中药材共 6种，分别为：半枝莲（59.48%）、钩藤（56.04%）、赤芍（53.14%）、臭蚤草（52.97%）、扁蒿（52.31%）和北豆根（50.05%），占比3.85%；抑制率低于50%的共有140种，占比89.74%。筛选结果进一步证实中药材是筛选治疗痛风药物的良好资源，其中毛细辛显示了进一步研究的价值。 3. 细辛属植物中小分子化合物 XO 抑制剂的虚拟筛选：通过文献检索、数据库查询等手段获得细辛属植物中 243 个小分子化合物作为配体数据库。选择 XO 的晶体结构 1N5X 作为受体数据库，以 1N5X 晶体结构中的原配体 TEI6720 为参照，应用 DS2016 软件进行分子对接，对比分析原配体和别嘌醇作用于 1N5X 的主要活性残基以及作用力。最终虚拟筛选获得打分高于TEI6720的化合物共15个，其中有2个为黄酮类化合物，占比13.33%，苷类化合物有7种，占比46.67%，提示毛细辛抑制XO活性的物质基础可能主要为黄酮及其苷类化合物。研究结果将为毛细辛中 XO 抑制剂的进一步分离提供理论指导。 4. 毛细辛中 XO抑制剂的跟踪分离：本章对前期筛选获得的有较高 XO抑制活性的中药材毛细辛进行研究。采用沸水浴回流提取法对毛细辛进行提取，以 XO 抑制活性为导向进行跟踪分离，评价了毛细辛中抑制 XO 活性成分的热稳定性以及酸碱稳定性，通过萃取的方法对毛细辛水提物进行了初步分离，XO抑制活性的测定结果显示，毛细辛乙酸乙酯相具有较高的抑制活性，其 IC50 达到 0.023 mg/mL（别嘌醇 IC50 = 0.010 mg/mL）。从乙酸乙酯相共分离鉴定了 11 个化合物，分别为邻苯二甲酸二丁酯、马兜铃内酰胺、马兜铃内酰胺Iva、马兜铃酸I、马兜铃酸Iva、对羟基苯甲酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、柚皮素、山奈酚、Iseluxine和七叶内酯，其中山奈酚对XO显示出较高的抑制活性（IC50 = 104.8 μmol/L），与阳性药别嘌醇（IC50=73.5 μmol/L）活性相当。对山奈酚通过 DS 2016 分子对接软件进行对接分析，获得对接打分为 117.24，原配体为122.18，说明山奈酚与XO有较好的作用方式，为后期筛选得到较好的XO抑制剂提供了理论基础。 5. 药食同源类中药抗痛风组方设计与优化：以我国卫健委所确认的 105 种药食同源类药材为资源，通过沸水浴回流提取法进行制备。以 XO 为主要靶点，腺苷脱氨酶为次要靶点进行筛选，将具有较高 XO 和腺苷脱氨酶抑制活性的药食同源中药材用于组方设计，并使用单因素实验和响应面实验对组方进行优化，最终获得最优的组方配比为：杭菊 23.68 g、紫苏叶 10.00 g和槐花 21.58 g，该组方对 XO抑制率达到 81.63%，显示了进一步研究的价值。 6. 中药组方对高尿酸血症模型小鼠的作用研究：本研究通过腹腔注射 300 mg/kg氧嗪酸钾诱导雄性昆明小鼠形成高尿酸血症，通过连续 7 天的干预治疗后，对小鼠体重、行为学变化、血清尿酸、血清肌酐、尿酸氮、血清 XO 和腺苷脱氨酶活性、尿尿酸、尿肌酐以及脏器系数等指标进行测定，以此评价组方对高尿酸血症小鼠的治疗效果和保护作用。结果显示，与正常组相比，各组小鼠体重正常，没有发生异常行为学的改变。与模型组相比，组方的高剂量组均能显著降低血清尿酸、肌酐、尿素氮水平以及XO活性和腺苷脱氨酶酶活性（P ＜ 0.01），且高剂量组和阳性组（别嘌醇）之间无显著差异。与模型组相比较，组方高中低剂量组能够显著升高尿尿酸含量（P ＜ 0.01），且高低剂量的效果优于阳性药（P ＜ 0.05），高中低剂量组以及阳性组对尿肌酐的含量没有产生影响。
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