摘要
全苗、齐苗、壮苗是玉米提高产量的重要前提条件，播种深度与玉米发芽出苗的关系密切，适当深播可有效改善干旱、低温等环境信号对玉米幼苗的伤害，同时深播的玉米由于根系伸展较深，抗旱和抗倒伏能力也相应增强。为了加大播种深度，玉米种子必须拥有较强的耐深播能力，而想要种子有较强的耐深播能力，就需要有较强的顶土能力和较高的种子活力。在玉米耐深播性评价体系中，出苗率是一个重要指标，出苗率越高，表明耐深播性越强；出苗率首先与中胚轴的长度极显著相关，其次是胚芽鞘和幼苗长度。近年来水稻中已有少数中胚轴伸长相关基因被克隆，而玉米中定位到的中胚轴伸长QTL还较少，且没有一个中胚轴伸长相关基因被克隆。本研究从渐渗系群体中筛选长、短中胚轴极端材料并构建分离群体进行中胚轴伸长QTL定位，同时结合自然群体耐深播相关表型GWAS分析，挖掘中胚轴伸长主效QTL并研究其功能，为培育深土直播玉米品种、提高玉米环境适应能力和产量打下基础。主要研究结果如下： 1. 中胚轴伸长QTL定位分离群体构建及相关表型测定。从755份BC3DH材料中筛选出长、短中胚轴极端材料构建F2及BC分离群体用于QTL定位；多环境下种植的极端材料中胚轴表型均表现出较高的遗传力，即极端材料中胚轴表型受环境因素影响，但主要由遗传因素决定，且能稳定遗传。筛选出的长中胚轴极端材料在15cm播深下表现出较强的顶土出苗能力，出苗速度、出苗率均明显优于短中胚轴极端材料；通过细胞学观察分析，发现在极端材料中，细胞分裂、细胞伸长共同决定中胚轴长度。 2. 中胚轴伸长QTL定位。从1800个F2单株中挑选出表型分布两端的长、短中胚轴材料各30份以及亲本材料A13、A19，构建长、短中胚轴混池及亲本池进行BSA测序，通过不同算法和不同窗口、步长大小进行拟合作图确定Chr.2：194M附近为候选区间，并筛选到6个候选基因。开发InDel标记对BSA结果进行QTL作图验证，多环境、多群体作图结果显示Chr.2标记2-16至2-38为初定位区间；在初定位区间内加密标记并利用F2∶3、F3∶4及BC1F2∶3家系进一步将候选区间缩小至标记Y1-Y3之间（796 Kb，Chr.2：194.12-194.92M）；候选区间内总共包含26个基因，其中包括BSA所得候选基因Zm00001d005969、Zm00001d005970。 3. RNA-seq及候选基因关联分析。对极端亲本A13、A19中胚轴进行不同时期的转录组测序，结合 BSA、QTL 精细定位共同筛选出 Zm00001d005969、Zm00001d005970 为候选基因；分别对两个基因进行候选基因关联分析， Zm00001d005969未检测到超过显著阈值的点，且单倍型间表型差异不显著。而Zm00001d005970则关联到了6个显著的SNP位点，其中3个SNP等位变异间中胚轴长差异显著。根据这3个SNP位点的等位基因类型总共划分出4种单倍型， Hap2、Hap3中胚轴长均极显著高于Hap1，且Hap3显著高于Hap2，位于启动子区域的S2_194260605-T可能是该基因引起中胚轴表型变化的重要等位变异。同时通过基因克隆发现A19中Zm00001d005970启动子区域可能存在大片段（转座）插入。 4. 候选基因Zm00001d005970（ZmDof2）功能验证。利用EMS突变体及过表达、敲除材料对ZmDof2的功能进行了初步验证，表型鉴定结果显示过表达阳性材料中胚轴长显著短于野生型；EMS突变体（ems-dof2）及zmdof2、zmdof2;16敲除材料中胚轴长显著高于野生型，zmdof16敲除突变体与野生型间无显著差异。结合前期极端材料A13、A19表型、序列分析及ZmDof2在其中的表达量差异，我们认为ZmDof2是中胚轴伸长的负调控因子，通过其表达水平的改变来控制中胚轴长。ZmDof2在多组织中表达，但在暗培养108 h后的中胚轴中表达量最高；玉米原生质体亚细胞定位显示ZmDof2蛋白定位于细胞核。 5. 耐深播相关表型全基因组关联分析。对2020崇州、2020云南、2021崇州三环境下种植的自然群体进行耐深播相关表型全基因组关联分析，中胚轴长（ML）、胚芽鞘长（CL）、胚芽长（PL）、苗长（SL）分别检测到23、6、4、4个共定位QTL；在显著SNP上下游LD=10 Kb范围内，分别有43、13、16、10个候选基因在两环境中被检测到；ML、PL、SL均在两环境下关联到基因Zm00001d002644 （ZmGCP2）。EMS突变体（zmgcp2）表型测定结果显示zmgcp2与野生型间中胚轴长差异不显著，胚芽长、苗长均显著降低；突变体胚芽细胞长度极显著短于野生型B73。因此我们认为ZmGCP2是胚芽长和苗长的候选基因，极有可能通过影响细胞扩张而改变胚芽长，进而引起苗长的改变。 6. ZmGCP2候选基因关联分析及优异单倍型鉴定。对GWAS关联到的关键基因ZmGCP2进行候选基因关联分析，PL、SL各检测到1个显著的SNP（S_18026077， S2_18027369），根据这两个SNP可将群体划分为4种单倍型，其中Hap1（AA）的PL极显著高于其余三种单倍型、SL极显著高于Hap3和Hap4，其余单倍型间差异不显著；因此我们推断Hap1为优异单倍型，且S_18026077-A为控制胚芽长及苗长的优异等位变异；Hap1中SS群材料占比极高，其次为我国杂种优势群唐四平头（SPT），而NSS及其余种群占比极少，因此我们推测该基因在玉米育种过程中经过了选择，有利的Hap1等位基因可用于现代育种。
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