摘要
背景：Argonaute（Ago）蛋白是一大类核酸内切酶，一些原核生物的 Ago 蛋白（Prokaryotic Ago，pAgos）利用 5′-磷酸化或羟基化的短 DNA为向导（Guide DNA，gDNA）定点切割互补的靶标。尽管 Ago 蛋白在疾病诊断和基因编辑方面具有很大的潜力，但目前大多gDNA/Ago系统反应温度较高（60-95℃），且双链 DNA（Double-strand DNA，dsDNA）的切割能力有限，限制了其广泛应用。以 Thermus thermophilus Argonaute （ TtAgo ）为例，其反应温度 65-85℃，对单链 DNA （ Single-strand DNA，ssDNA）的切割活性明显高于dsDNA。我们课题组前期研究发现， 2'-氟修饰gDNA（2'F-gDNA）可以显著增强TtAgo的ssDNA切割活性，其机制是：2'-氟修饰增强了 gDNA 与靶核酸的结合力，促进Ago/gDNA/Target三元复合物形成。与切割ssDNA不同，用一对互补的2'F-gDNA切割dsDNA时反而出现活性降低的现象。故本研究将进一步探索2'F-gDNA增强TtAgo体外切割dsDNA活性的策略，并进一步拓展2'F-gDNA/TtAgo的生物技术应用。 目的： 1.建立2'F-gDNA增强TtAgo体外切割dsDNA活性的方案。 2.建立基于2'-氟修饰gDNA/TtAgo的可编程核酸内切酶及新型核酸检测技术。 方法： 1.根据2'F-gDNA增强TtAgo活性机制，本研究对dsDNA切割活性差的原因做出合理推测：切割dsDNA时需要一对gDNA，但氟修饰不仅增强了gDNA与靶核酸的结合力，同时也促进这对互补gDNA之间的结合，进而造成2'F-gDNA入侵dsDNA的能力减弱和gDNA之间相互切割，最终导致dsDNA的切割活性降低。因此，本研究提出2'F-gDNA增强TtAgo-dsDNA切割活性的新策略：通过错开互补2'F-gDNA的方法，来减弱gDNA之间碱基配对，以及避免gDNA之间的相互切割，从而增强2'F-gDNA/TtAgo的dsDNA切割活性。 2.本研究采用化学合成2'F-gDNA、凝胶电泳、聚合酶链反应、实时荧光分析等方法，探索不同因素对2'F-gDNA引导增强TtAgo切割DNA的影响，如2'F-gDNA的长度、温度、3'端碱基不同、GC含量、不同位置氟修饰gDNA以及与2'F-gDNA进行联合修饰等。同时验证了2'F-gDNA对PfAgo切割活性的影响。 3.针对质粒DNA设计系列错开的2'F-gDNA，观察切割质粒DNA的效率，验证2'F-gDNA/TtAgo有作为可编程限制性内切酶的可行性。 4.基于2'F-gDNA/TtAgo建立新型核酸检测技术。设计带有标记荧光FAM和BHQ的引物，利用2'F-gDNA介导TtAgo增强dsDNA切割活性，验证2'F-gDNA增强TtAgo切割dsDNA活性用于核酸检测的可行性。 结果： 1.发现2'F-gDNA切割dsDNA时活性降低的现象，并阐明其原因：2'F-gDNA在增强gDNA与靶核酸的结合力的同时，也加强gDNA之间互补配对，从而导致与靶核酸配对的2'F-gDNA减少，最终导致dsDNA的切割活性降低。 2.提出错开互补2'F-gDNA的方法，验证错开有效增强TtAgo对dsDNA的切割；3'端2'F修饰的gDNA增强效果较好，且3'端碱基序列与活性增强效果密切相关；2'F-gDNA 的长度为 18 nt 时，切割活性较好，与文献报道一致。 3.发现2'F-gDNA可抑制TtAgo对dsDNA的“chopping”现象。 4.2'F-gDNA可以增强PfAgo切割ssDNA的活性，验证了2'F-gDNA增强Ago蛋白DNA切割活性的广泛实用性。 5.2'F-gDNA/TtAgo可高效切割质粒DNA，其切割活性显著优于非修饰的gDNA/TtAgo，验证了其作为可编程限制性内切酶的可行性。 6.建立了基于2'F-gDNA/TtAgo的新型核酸检测技术，实现了对靶核酸特异性的实时荧光检测，初步验证了该方法的可行性。 结论： 本研究发现2'F-gDNA/TtAgo切割dsDNA活性差的原因，建立错开互补2'F-gDNA增强TtAgo-dsDNA切割活性的新策略，并基于该策略构建了可编程核酸内切酶和新型核酸检测技术。
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