摘要
青花菜(Brassica oleracea L.var.italica Plench)富含多种营养保健物质，其中含硫次生代谢产物萝卜硫素具有解毒、防御病虫害和抑制癌细胞生长的功效，影响萝卜硫素生物合成与调控的因素有很多，如基因型、外源物质及植物激素等。课题组前期研究发现，外源喷施MeJA可以促进青花菜硫苷和萝卜硫素的积累，同时发现硫苷合成的相关基因表达也会相应变化，其中脂肪族硫苷合成途径关键酶基因CYP83A1可能响应MeJA诱导参与萝卜硫素生物合成途径。本论文在前期基础上，通过基因功能分析深入探究BoCYP83A1基因响应茉莉酸甲酯影响青花菜萝卜硫素合成的分子机制，为进一步解析MeJA调控青花菜萝卜硫素积累的分子机制提供理论证据。本文的主要研究结果如下: 1.青花菜BoCYP83A1基因克隆与生物信息学分析结果表明BoCYP83A1全长1506bp,含501个氨基酸序列;亚细胞定位结果表明其定位于细胞膜、细胞质和细胞核;进化分析结果表明其与甘蓝亲缘关系最近，其次为油菜、大白菜、小白菜。青花菜BoCYP83A1蛋白的氨基酸序列与甘蓝、油菜、大白菜、小白菜的同源性分别达到99.6％、99.4％、99％、98.21％。 2.利用遗传转化手段获得青花菜BoCYP83A1过表达和干扰植株，RT-qPCR分析显示过表达株系中CYP83A1表达量均高于对照5倍以上，干涉株系中CYP83A1表达量均低于对照5倍以下。通过HPLC检测发现，过表达株系中脂肪族硫苷含量分别是野生型青花菜2.11和2.29倍，与之相反，在干涉株系中，脂肪族硫苷的含量呈显著下降趋势。同时对比萝卜硫苷含量发现，过表达株系与野生型相比分别提高了 1.02倍和1.2倍，干涉株系比野生型分别降低了 1.83倍、1.25倍和1.77倍。以上结果表明，BoCYP83A1在硫苷合成途径中主要参与脂肪族硫苷的合成，并且在硫苷和萝卜硫素的合成途径中具有重要作用，同时，在cyp83a1突变体中也进一步证实了 CYP83A1能够响应MeJA影响萝卜硫素含量的积累。 3.青花菜BoCYP83A1启动子功能分析发现，其包含胁迫防御等多方面的调控元件，且对MeJA处理有较高的活性响应;采用文库筛选获得4个候选转录因子BoMYB68、BoIAA18、BoSOC1和BoSYP122,酵母单杂和双荧光素酶实验显示这4个转录因子能够与BoCYP83A1启动子结合并有互作效应，表明BoCYP83A1可能通过与上游转录因子BoMYB68、BoIAA18、BoSOC1、BoSYP122的结合来实现茉莉酸甲酯介导的萝卜硫素积累。
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