摘要
聚酮类化合物(Polyketides)是一类具有多种结构以及不同生物活性的次级代谢产物。这些代谢产物表现出不同的药理学特性，包括抗菌，抑制真菌，抗寄生虫，抗氧化和抗癌等。该类化合物由聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)通过缩合一系列酰基CoA后环化修饰而成。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)是一类具有超强电离辐射抗性，UV辐射抗性以及抗氧化，抗干燥等非生物胁迫抗性的微生物。该菌含有两个Ⅲ型聚酮合酶，DrPKS1(DR_2091,drpks1)与DrPKS2(DR_A0326,drpks2)，但是两个酶的具体功能仍然未知。本研究工作通过构建单缺失突变株和双缺失突变株，以及构建两个基因的大肠杆菌蛋白表达菌株，利用高压液相色谱(HPLC)和抗逆相关生理生化实验分析两个基因的功能，得到结果如下: drpks1基因全长1083bp,编码蛋白含有360个氨基酸残基，分子量约为38.1 kDa。drpks2基因全长1317bp,编码蛋白包含438个氨基酸残基，分子量约为46.6 kDa。氨基酸序列比对发现，DrPKS1与已知功能的菜豆根瘤菌RePKS序列一致性最高，为40.06％,其次是枯草芽孢杆菌BpsA,序列一致性为39.30％;DrPKS2与密苏里游动放线菌AgqA的序列一致性最高，但仅为28.34％。DrPKS1和DrPKS2都具有Ⅲ型聚酮合酶典型的αβαβα折叠结构，并且其催化活性中心的Cys,His和Asn三个氨基酸残基都十分保守。 野生型菌株不同生长时期的实时定量PCR结果表明，drpks1于稳定后期大量表达，drpks2始终微量表达。对野生型菌株和突变株代谢产物的高压液相色谱(HPLC)分析表明，在培养时间达到约48小时，相比于野生型，双缺失突变株多出两个产物吸收峰，其吸收光谱显示该化合物在波长200nm,220nm和290nm处有特征吸收信号。 野生型菌株和各突变株的生长曲线表明，△drpks2自对数初期起其生物量高于其他三株菌。△drpks1培养至48至60小时其菌液颜色比其他菌株浅。在不同浓度过氧化氢，15％乙醇,5MNaCl，3M山梨醇和UV辐射胁迫下，野生型菌株和各突变株生存状况均没有明显区别。 为获得具有体外活性的DrPKS1和DrPKS2蛋白，本研究构建了大肠杆菌蛋白表达菌株，同时构建了 DrPKS1在戈壁异常球菌中同源蛋白DGoPKS的蛋白表达菌株。通过对蛋白表达菌株次级代谢产物进行HPLC分析发现，DrPKS1表达菌株比对照菌株多出一系列产物吸收峰，该一系列产物与耐辐射异常球菌双缺失突变株所产的化合物在结构上相似，其吸收波谱相似。DGoPKS表达菌株的结果与DrPKS1相似。 对各蛋白表达菌株进行一系列胁迫实验发现1mM过氧化氢冲击30分钟，三株蛋白表达菌株的生存率比对照菌株低2到3个数量级，其中DrPKS2表达菌株的生存率比另外两株蛋白菌株低一个数量级。2M NaCl冲击2小时，三株蛋白表达菌株的生存率比对照菌株低2个数量级，各蛋白表达菌株的生存率基本一致，表明DrPKS1与抗逆有一定的关系。 本研究基本探明了耐辐射异常球菌Ⅲ型聚酮合酶DrPKS1和DrPKS2的功能，成功构建了蛋白表达菌株，为进一步纯化蛋白，进行体外反应实验奠定了基础。酶的反应底物与代谢产物的结构，代谢途径的探明，酶的三维结构，反应活性位点与产物结构之间的关系以及反应过程中产物的缩合，环化和修饰的具体机制仍有待于进一步研究。
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