摘要
基于单细胞测序解析肿瘤微环境重塑调控结直肠癌腹膜转移的机制研究 背景: 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)在全球的发病率与死亡率分别位居第三和第二，这突显了其对全球公共健康的重大威胁。腹膜转移(peritoneal metastases,PM)是CRC最常见的远处转移之一，仅次于肝和肺转移。CRC-PM若不治疗，预后通常很差，中位生存期大约只有5个月。肿瘤细胞减灭术结合腹腔热灌注化疗(CRS/HIPEC)是目前唯一可望治愈的治疗策略。鉴于针对CRC-PM患者的治疗策略有限，迫切需要深入了解结直肠癌腹膜转移的生物学机制，以便确定促进PM形成的风险因素，并找到新的治疗靶点。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术可揭示肿瘤细胞的起源及肿瘤微环境细胞的多样性，为理解CRC的发病机理及寻找新的治疗靶点提供宝贵的见解。然而，关于CRC腹膜转移的单细胞研究仍然稀缺。因此，本研究旨在建立CRC-PM患者的配对队列，并通过scRNA-seq来探索腹膜转移中肿瘤细胞转录组的变化和肿瘤微环境(tumor microenviroment,TME)的重塑。通过多维度数据分析和体内外的实验验证，我们发现了促进结直肠癌腹膜转移的TME关键性重塑机制，并提出了针对腹膜转移形成的潜在的新治疗靶点。 方法: 从本中心收集了 12例结直肠癌(CRC)合并同时性腹膜转移(PM)患者的原发癌、原发癌旁正常组织、转移癌及转移癌旁正常腹膜共45个组织样本进行单细胞RNA测序。9例患者的所有配对病灶均被完整收集，确保样本比较的高度一致性。经质控，获得429,947个细胞用于分析。首先，我们对肿瘤细胞进行CRC-PM之间，拷贝数变异(inferCNV)、差异基因、基因模块和细胞轨迹分析的比较，探讨了 PM和CRC之间的基因功能差异，寻找出促进PM的关键通路和基因，通过体外克隆形成、transwell侵袭和划痕实验验证相关基因促进肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移能力，通过体内皮下移植瘤和腹腔注射游离肿瘤细胞模型验证相关基因促进肿瘤生长和腹膜转移的能力，并探讨相关基因调控腹膜转移的分子通路机制;其次，我们基于肿瘤细胞的转录组异质性结果，结合PM的病理特征，进而关注间质细胞亚群，采用细胞比例和细胞密度分布分析确认PM中缺失和富集的细胞亚群，采用基因功能和细胞轨迹分析聚焦间皮细胞，采用细胞交互分析确认PM中间皮细胞与肿瘤细胞的协同促进作用，体外实验采用多重免疫荧光染色、共培养、transwell迁移和细胞粘附实验验证间皮细胞与肿瘤细胞的协同促进作用，体内实验构建腹腔注射游离肿瘤细胞模型和盲肠原位模型验证抗间皮细胞治疗抑制PM的形成;接着，我们聚焦肿瘤相关性巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)亚群，通过细胞比例、细胞密度分布和组织偏好分析确认C1QC+TAM特异性富集在PM中，采用基因功能分析确认其极化表型，采用细胞交互分析确认其促进PM的作用，体外实验采用多重免疫荧光染色、本中心组织芯片分析、流式细胞分析、共培养实验和细胞功能学实验验证其对PM肿瘤细胞的作用，体内实验采用腹腔注射游离肿瘤细胞模型验证其对PM形成的作用;最后，聚焦PM中存在的ISG15+TAM亚群，采用公共单细胞RNA结合组织RNA测序的免疫治疗队列分析ISG15+TAM与免疫疗效的关系，采用dMMR/pMMR肠癌单细胞RNA数据分析ISG15+TAM与结直肠癌错配修复状态的关系，采用本中心组织芯片队列验证ISG15+TAM与结直肠癌错配修复状态的关系，体外实验采用共培养分析其与CD8T细胞的关系，体内实验采用巨噬细胞结合PD1抗体治疗分析其与CD8 T细胞的关系。 结果: 基于肿瘤细胞，拷贝数变异分析(inferCNV)发现，大部分患者(50％)的PM较CRC肿瘤细胞具有更高的拷贝数变异。转录组异质性分析显示，CRC肿瘤呈现肿瘤干性增强，PM肿瘤细胞表现出上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)活性增强的特点。基因差异分析聚焦调控EMT通路的关键转录因子NR2F2,其在PM中呈现高表达的趋势。体内外实验表明NR2F2可显著促进肿瘤生长和腹膜转移的能力。分子实验表明NR2F2正向调控EMT通路促进CRC形成PM。 基于间质细胞，基因功能结合细胞轨迹分析显示，PM中缺失间充质干细胞而富集成纤维细胞，间皮细胞代替间充质干细胞成为成纤维细胞的细胞起源，这一过程是由间皮细胞激活间皮-间充质转化(mesothelial-mesenchymal transition,MMT)通路来实现的。体外共培养实验表明，间皮细胞与肿瘤细胞相互接触，诱导对方增强间充质转化活性，促进肿瘤细胞转移能力和间皮细胞向成纤维细胞转化的能力。体内实验表明，抗间皮细胞标志基因MSLN抗体治疗可阻断间皮细胞和肿瘤细胞的相互诱导作用，抑制PM的形成。 基于巨噬细胞，单细胞分析发现C1QC+TAM高度富集在PM中，并高表达M2极化的相关基因。与PM肿瘤细胞交互分析显示，C1QC+TAM可显著增强肿瘤细胞增殖、干性和转移能力。体外实验表明，C1QC的表达诱导巨噬细胞向M2极化，促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力。体内实验表明C1QC+TAM促进肿瘤形成PM。 最后，单细胞RNA(scRNA-seq)结合组织转录组(bulk RNA)分析显示，PM中存在的ISG15+TAM在免疫治疗(PD1抗体或CTLA4抗体)有效组和dMMR/MSI-H型肠癌中显著富集，提示其和抗肿瘤免疫反应密切相关。体内外实验表明ISG15+TAM呈现M1极化状态，激活CD8 T细胞的细胞毒性杀伤功能，抑制肿瘤的生长。 结论: 本项目采用结直肠癌配对腹膜转移的单细胞RNA分析，结合体内外多种实验手段，展示了 CRC-PM过程中，恶性肿瘤细胞的基因功能变化(PM肿瘤EMT活性增强)和肿瘤微环境的重塑(PM中间皮细胞MMT活性增强和PM中C1QC+巨噬细胞富集等)相互促进，以创造促进肿瘤生长和腹膜转移的条件。了解这些变化背后的生物学机制，对于探索结直肠癌腹膜转移干预和治疗的潜在靶点至关重要。
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