摘要
目的：本研究通过建立猕猴酒精性肝病（Alcoholic liver disease, ALD）模型，探究ALD的发病机制，并评估益生菌干预对猕猴酒精性肝损伤的保护作用。 方法：分组灌服乙醇溶液。将8只猕猴随机分为3组，酒精组（A组）、益生菌干预组（B组）和对照组（C组），每组1-4只，用无水乙醇按照2.5 g/kg配制成50%的酒精溶液，对酒精组和益生菌干预组每周分别灌胃2次，持续40周（40 W），同时，益生菌干预组猕猴每天每只给予1×109 CFU肠道益生菌粉溶液饮用持续40 W，对照组进行相同的饮用水灌胃操作。通过以下实验对研究结果进行评估：（1）检测肝功能生化指标，包括丙氨酸转移酶（Alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸转移酶（Aspartate transaminase, AST）、总胆红素（Total bilirubin, TBIL）、直接胆红素（Direct bilirubin, DBIL）、总胆固醇（Cholesterol, CHOL）、甘油三酯（Triglyceride, TRIG）、总蛋白（Total protein, TP）、白蛋白（Albumin, ALB）、球蛋白（Globulin, GLO）、肌酐（Creatinine, CREJ）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）和谷氨酰转移酶（γ-Glutamyltransferase, GGT）；（2）对肝脏组织进行B超成像分析；（3）通过苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining, HE）和Masson染色观察组织病理学变化；（4）通过水溶性四唑盐（Water-soluble tetrazolium salts-1, WST-1）法与硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid test, TBA）法分别检测血清与肝脏组织中氧化应激相关标志物超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase, SOD ）和丙二醛（ Malondialdehyde, MDA）；（5）采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法检测血清中炎症因子白细胞介素 1β（ Interleukin-1β, IL-1β）、趋化因子白细胞介素 8 （Interleukin-8, IL-8）和抗炎因子白细胞介素10（Interleukin-10, IL-10）；（6）通过微板法检测血清中游离脂肪酸（Non-estesterified fatty acid, NEFA）、二胺氧化酶（Diamine oxidase, DAO）、D-乳酸（D-lactic acid, D-LA）和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）来分析肠道通透性；（7）收集猕猴粪便，通过16S rDNA测序分析猕猴肠道菌群结构变化；（8）采用LC-MS/MS分析进行非靶代谢组学分析。 结果：（1）酒精代谢实验：按1.5 g/kg、3.0 g/kg和4.0 g/kg体重剂量摄入乙醇溶液的三组猕猴，血浆乙醇含量均在摄入后2 h达到峰值，在48 h降到最低；摄入乙醇24 h后ALT和AST水平达到峰值，两者差异显著（P＜0.05），48 h后4.0 g/kg剂量组猕猴的ALT还未恢复至正常水平。（2）猕猴酒精性肝损伤模型的建立：长期饮酒后猕猴的体重减轻；通过HE染色与Masson染色结合B超影像分析表明，酒精组猕猴出现不同程度的脂肪肝和局部胶原纤维增生，在饮酒建模的不同阶段观察到不同程度的肝腹水，而对照组未出现局部胶原纤维增生与肝腹水的情况；酒精组猕猴与对照组猕猴相比肝功能指标ALT、AST、TBIL和DBIL的值显著升高，生化指标TP、ALB、CREJ、ALP和GGT的值显著升高，差异显著（P＜0.05）。（3）益生菌干预对猕猴酒精性肝损伤模型的保护作用：猕猴益生菌干预组与酒精组相比，益生菌干预组猕猴肝功能指标ALT、AST、TBIL、DBIL和CHOL水平显著降低，生化指标ALB和CREJ水平显著降低，差异显著（P＜0.05）；益生菌干预组猕猴SOD活性显著提高，血清中MDA浓度显著降低，差异显著（P＜0.05）；猕猴益生菌干预组与酒精组相比，益生菌显著降低了炎症因子IL-1β、趋化因子IL-8与抗炎因子IL-10水平；益生菌的干预显著降低血清中NEFA、D-LA和LPS值，差异显著（P＜0.05）。（4）通过微生物多样性与代谢组学分析益生菌干预酒精性肝损伤的保护作用：与酒精组相比，益生菌组显著增加了猕猴肠道菌群多样性；益生菌干预增加了有益菌疣微菌门等的丰度，且比酒精组更接近对照组的菌群；通过京都基因和基因组大百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）功能的预测分析，结果表明益生菌通过细胞膜/包膜生物发生与细胞骨架活动恢复肠道屏障，通过加速氨基酸的运输与代谢，DNA的重组和修复来减少酒精对宿主造成的肝损伤；通过表型预测分析，益生菌干预组在形成生物膜和胁迫耐受性方面可能有助于减轻酒精诱导的肝损伤；益生菌干预后特有代谢物数量变多，可能存在潜在调整代谢途径的化合物，如：萜类化合物；对差异显著的代谢物进行KEGG通路分析时富集到细胞色素P450代谢途径、鞘脂代谢与鞘脂信号通路、色氨酸代谢、α-亚麻酸代谢途径均与肠道屏障完整性有一定关系，益生菌干预后可能会通过调整以上代谢通路恢复肠道屏障来改善酒精性肝损伤，以上代谢通路也为治疗酒精性肝病研究提供了新思路。 结论：益生菌对酒精性肝损伤猕猴具有一定的保护作用，其机制与减轻氧化应激反应，抑制肝脏炎症，修复肠道屏障，改善猕猴肠道菌群及其代谢物有关。
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