摘要
背景: 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种以免疫系统异常攻击肝脏细胞为特征的慢性炎症性肝脏疾病，发病机制复杂，包括遗传因素、环境触发因素以及免疫调节异常等。AIH的发病率正逐年上升，现已成为非感染性肝病的主要病因之一。尽管现代医学在AIH的诊断与治疗方面取得了一定进展，但仍存在一些挑战，如诊断标记物的缺乏、诊断标准的有限性、肝活检的有创性以及个体治疗反应的差异性。中医以整体观为基本原则，强调辨证施治，通过识别个体体质、病机类型来指导治疗，或可为AIH的管理提供新思路。然而，中医在AIH领域的研究相对较少，中医病因病机特征尚不明确。此外，随着生物信息学的发展，转录组测序作为一项先进技术，为疾病机制研究及新型诊断标志物的发现提供了可能。因此，探索AIH患者的中医体质、临床病理及预后特征，构建无创诊断模型，基于转录组学差异基因的筛选，对于理解AIH疾病特征、提高AIH诊断准确率及简便性、理解其病理机制以及指导个体化治疗具有重要意义。 目的: 本研究的目的在于深入探讨AIH的中医体质、临床表现、病理特征，观察其疗效，并研究它们之间的相关性。我们希望通过本研究能够清晰描述国内AIH患者的临床特点，并为中医药在AIH的诊断与治疗过程中提供新的理论支撑和方法思路。同时，本研究将评估当前AIH诊断标准在国内肝病患者群体中的诊断效能，并尝试通过常见的临床及实验室指标来构建一个无创的AIH诊断模型，以期提升AIH诊断的准确性和便利性。此外，本研究还计划基于转录组学利用生物信息学技术筛选与AIH相关的差异表达基因，以深化对AIH发病机制的理解，为AIH的诊断和治疗提供新的方向和策略。 方法: 1.本研究通过回顾性纳入2017年1月至2021年12月间经肝活检确诊为AIH、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cholangitis,PBC)、AIH-PBC 重叠综合征(AIH-PBC overlap syndrome,OS)、药物性肝损伤(drug induced liver injury,DILI)、非酒精性脂肪肝病、慢性乙型肝炎的患者，并收集纳入患者的基本资料、实验室检查结果、肝组织学表现等。并对AIH患者肝脏病理切片进行Ishak评分，通过调查问卷收集AIH患者中医体质分类结果。详细描述不同肝病患者的中医体质、临床及病理特性，探索AIH患者中医体质类型与临床、病理指标间的相关性，并检验AIH诊断标准在本研究队列中的适用性。 2.基于临床常见指标，开发AIH无创诊断模型，并通过交叉验证的方式评估该模型在内外部队列中的诊断性能。 3.在2023年3月至9月期间，共收集了 13例被诊断为AIH的患者肝活检组织样本，并选取了 7例肝血管瘤患者瘤旁的肝活检组织作为正常对照组。将收集肝组织样本送转录组测序，通过生物信息学方法分析测序数据，确定与AIH相关的差异表达基因。随后进行功能富集和网络调控分析，筛选出AIH相关网络核心基因。最终，我们选定四个核心基因，通过免疫组化实验对这些基因的表达进行验证。 4.我们将通过两个维度来评估影响AIH患者治疗效果的因素:首先，我们将分析影响患者首次实现生化缓解所需时间的因素;其次，从治疗反应的角度(基于治疗6个月后应答效果)，深入探讨各种因素对患者治疗效果的影响。 结果: 1.临床特征研究:共纳入879例患者，其中AIH344例。气虚、郁、湿是AIH患者最主要的中医体质证素类型。不同肝病组间生化指标、免疫球蛋白水平及组织学表现均存在显著统计学差异，p＜0.05。自身免疫抗体中，ASMA在不同肝病组间均有显著差异，ANA在AIH和PBC组间差异显著。AIH患者中，年龄、ALT、AST、ALP、GGT、IgG、PT、INR、TB、DB和TBA均与Ishak评分呈正相关，ALT、AST与纤维化呈负相关。ALB与Ishak评分呈负相关。AIH患者不同中医体质证素间与临床变量和Ishak评分间统计学相关性不显，仅数值上来看，气虚、郁、湿、血虚体质中女性占比相对较高，郁证体质患者ALT和Ishak评分相对较高，而胆红素及IgG水平在湿性体质中水平较高。三种诊断标准中，新组织学标准AUC为0.9105,简化标准AUC为0.7645,简化标准中组织学评分AUC为0.8270。 2.构建无创诊断模型:共纳入1303例患者，308例(23.6％)为AIH，995例(76.4％)为非AIH。将患者随机分为两组，其中70％(n=912)为训练集，30％(n=391)为内部验证集。另外128例(58例为AIH)来自外院会诊患者为外部验证集。LASSO回归法筛选出11个变量构建Logistic回归模型，分别为性别、年龄、ALB、ALP、ALP/AST、TBA、IgG/ULN、LP、AMA、AMAM2、HBsAg,并应用Nomogram模型使模型更为直观。训练集中AUC值为0.869,内部验证集AUC值为0.850,外部验证集AUC值为0.830。 3.转录组学:通过生信分析筛选出在AIH组较正常对照组上调基因245个，下调基因54个。GO富集分析显示差异基因功能主要富集在免疫系统相关的生物过程调节异常，特别是在免疫调节和细胞信号传导等方面。KEGG富集提示了与反应免疫系统的活跃性、异常免疫应答、免疫抗原识别和T细胞活化等相关的通路在AIH中的重要性。网络调控分析筛选出核心基因，如CD8A、CD27、IFNG、GZMB等。最终利用免疫组化实验验证了 CD27、GZMB、CD3E和CD8A在AIH患者肝组织中的表达，支持转录组测序分析结果。 4.疗效观察:共249例患者在随访期内达到生化缓解，实现首次缓解时间为82(29-257)d不同中医体质组别患者实现生化缓解时间统计学差异不显著。GLO、IgG水平与实现生化缓解时间呈正相关。 结论: 1.气虚、郁、湿是AIH患者最主要的中医体质证素类型，气虚、郁、湿、血虚体质中女性比例相对较高，郁证体质ALT和Ishak评分相对较高，而胆红素及IgG水平在湿性体质中水平较高。 2.自身免疫性肝病均以女性好发，年龄主要集中于45-60岁之间。生化水平上，AIH与DILI组表现相似，均表现为肝细胞损伤型炎症，ALT、AST水平较其他组别显著升高;胆红素、胆汁酸水平在AIH、OS和DILI组水平接近，较其他肝病组别明显升高;IgG水平在AIH和OS组升高最为显著。组织学表现上，AIH人群显示出较高程度的炎症和纤维化状态，且肝酶、胆红素、胆汁酸等生化指标与Ishak评分呈正相关性。 3.现行诊断标准中，新组织学标准诊断效能最佳，简化标准中组织学评分次之，整体来说，组织学标准诊断性能良好，印证了肝活检目前在AIH诊断中的必要性。基于常见指标，我们成功构建了一个无创诊断模型，经内外部验证，模型具有良好诊断性能。 4.基于转录组学分析，差异基因功能主要富集在免疫系统调节异常，特别是在免疫调节、细胞信号传导和T细胞活化等方面。经免疫组化实验验证核心基因表达情况，支持转录组测序结果。 5.疗效方面，GLO、IgG水平与实现生化缓解时间呈正相关。
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