摘要
目的 黑色素瘤是一种恶性程度极高的实体肿瘤，具有侵袭性强、易转移和预后差的特点，急需新的有效治疗策略。CD47作为新兴免疫检查点，在黑色素瘤细胞表面高表达，其可与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（Signal regulatory protein α,SIRPα）结合，传递“don't eat me”的信号来阻止抗肿瘤M1型巨噬细胞的吞噬，故阻断CD47有望增强巨噬细胞对肿瘤的杀伤作用。然而，现有的临床试验CD47抗体药物易导致溶血性贫血等副作用，且黑色素瘤中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）主要表现为促肿瘤生长的M2型巨噬细胞。为此，本研究旨在构建负载CD47-溶酶体靶向嵌合体（Lysosome-targeting chimeras,LYTAC）的中药猪苓多糖（Polyporus umbellatus polysaccharide，PPS）微针，其中的PPS用于刺激M2型TAMs向M1型极化，同时使用LYTAC靶向降解黑色素瘤细胞表面的CD47,减少肿瘤细胞的免疫逃逸，进一步增强M1型TAMs清除肿瘤细胞的能力，避免使用CD47抗体对红细胞的毒副作用，以期为黑色素瘤的免疫治疗探索新的途径。 方法 1.设计构建新型LYTAC骨架分子M6Pn,并以M6Pn-Biotin作为LYTAC模型分子，用高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）和质谱（Mass spectrometry,MS）对其进行表征。结合流式细胞术（Flow cytometry,FCM）、高内涵成像系统和激光共聚焦显微镜考察M6Pn-Biotin介导模型蛋白经受体-溶酶体途径降解的功能。 2.基于M6Pn设计合成靶向CD47的LYTAC分子（M6P3-RS17），并用HPLC和MS对其结构进行表征。采用微量热泳动技术（Microscale thermophoresis,MST）测定M6P3-RS17与CD47的亲和力。进一步采用蛋白印迹法（Western blot,WB）、FCM和激光共聚焦显微镜等方法考察M6P3-RS17通过溶酶体途径降解黑色素瘤B16F10细胞表面CD47的作用，以及M1型巨噬细胞对M6P3-RS17处理后的B16F10细胞和红细胞的吞噬效果。 3.结合FCM、高内涵成像系统、蛋白组学和转录组学研究PPS对巨噬细胞极化的作用，并采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测PPS处理巨噬细胞后所分泌的细胞因子。进一步将PPS与M6P3-RS17联用，考察两者协同促进巨噬细胞对黑色素瘤细胞的吞噬作用。 4.为实现两者的联合用药，采用模具法制备负载M6P3-RS17的PPS微针（M6P3-RS17/PPS-MN）,并对其形态、溶解性、机械强度、药物分布、穿刺深度、载药量等指标进行表征。在此基础上，构建B16F10黑色素瘤荷瘤小鼠模型评价M6P3-RS17/PPS-MN的体内抗肿瘤作用，并用WB、FCM和免疫荧光染色检测B16F10肿瘤中CD47降解、CD4+/CD8+T细胞浸润和TAMs极化的情况，以此探讨M6P3-RS17/PPS-MN的作用机制。 结果 1.设计构建得到M6Pn-Biotin,该分子骨架能够发挥LYTAC的功能，当n=3时的降解作用最佳。M6P3-Biotin能剂量/时间依赖性介导中性亲和素650（NeutrAvidin-650,NA650）被B16F10细胞内吞，并通过溶酶体途径降解。 2.M6P3-RS17与CD47具有较高的亲和力（Kd=10.08±2.92μM），可剂量/时间依赖性通过溶酶体途径降解B16F10细胞表面的CD47,并促进M1巨噬细胞对B16F10细胞的吞噬，且对红细胞无明显影响。 3.PPS能够促进M0型巨噬细胞向M1型极化，同时将M2型巨噬细胞复极化为M1型，进而促进TNF-α的释放，减少TGF-β1的分泌，缓解免疫抑制微环境。转录组学和蛋白组学的结果与细胞水平一致，且进一步表明PPS能上调巨噬细胞吞噬的标志基因。当PPS与M6P3-RS17联用时，可协同促进巨噬细胞对黑色素瘤细胞的吞噬作用。 4.成功构建负载M6P3-RS17的PPS微针（M6P3-RS17/PPS-MN），其形貌均一，具有较高的安全性和皮肤穿刺强度。体内抗肿瘤实验结果表明，M6P3-RS17/PPS-MN可在体内降解黑色素瘤中的CD47,同时将M2型TAMs转化为M1型，通过肿瘤微环境的改善增加细胞毒性T细胞在肿瘤中的浸润，最终有效抑制黑色素瘤B16F10荷瘤小鼠的肿瘤生长。 结论 本研究创新性构建了一种负载CD47-LYTAC的PPS微针（M6P3-RS17/PPS-MN）,并开展其体内外抗黑色素瘤的作用评价。PPS能够增加肿瘤中M1型TAMs的比例，促进TAMs对黑色素瘤细胞的吞噬，并通过其包载的M6P3-RS17特异性降解黑色素瘤细胞表面的免疫检查点CD47,协同增强M1型巨噬细胞对黑色素瘤细胞的吞噬作用，期间未观察到类似CD47抗体治疗时产生的毒副作用。PPS与M6P3-RS17的联合作用能够进一步改善肿瘤免疫抑制微环境，促进CD4+T细胞的浸润，有效抑制黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长。本研究为LYTAC技术在多肽药物的开发提供创新思路，并为中药多糖在黑色素瘤的协同免疫治疗提供重要依据。
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