摘要
目的: 观察c-Myc/miR-27a/Wnt/β-catenin信号通路在肝星状细胞（HSC）活化的分子调控机制，并以此阐明扶正化瘀片（FZHY）治疗肝纤维化的作用机理，为FZHY治疗肝纤维化提供理论依据。 方法: 1.细胞实验:（1）用TGF-β1诱导HSC细胞（LX2和T6）活化，RT-qPCR检测miR-27a的表达;瞬时转染miR-27a的模拟物和抑制剂增强或抑制miR-27a的表达，CCK8法检测细胞增殖情况，Western blot法检测COL1A2、α-SMA、P-GSK3β、SFRP1和 PPARγ的表达。（2）通过数据库（http://www.cuilab.cn/transmir）预测 c-Myc 是 miR-27a 潜在上游转录因子之一;用c-Myc的抑制剂干预活化LX2细胞后，RT-qPCR检测miR-27a的表达;敲低c-Myc后，CCK8法检测细胞增殖情况，RT-qPCR检测miR-27a的表达，Western blot检测c-Myc和COL1A2的表达;敲低c-Myc后，加入TGF-β1诱导LX2细胞活化，Western blot检测c-Myc和COL1A2的表达。 2.动物实验:（1）雄性Wistar大鼠连续四周腹腔注射二甲基亚硝胺（DMN）造模，每周三次，剂量为10mg/Kg。造模第二周结束时，开始FZHY灌胃给药，FZHY低、中和高剂量分别为2g/Kg、4g/Kg和8 g/Kg，每日一次，连续四周。（2）造模结束后，记录大鼠体、肝、脾、肾质量及腹水体积;（3）收集大鼠血清，检测肝功能相关指标及miR-27a的表达;（4）取肝组织进行HE染色、天狼猩红染色、Hyp含量检测、Western blot和RT-qPCR分析。 3含药血清实验:（1）SPF级Wister雄性大鼠以4 g/kg和8 g/kg剂量给予FZHY浸膏稀释液灌胃，对照组喂以等剂量生理盐水，每天早晚各一次，连续给药5天，制备FZHY含药血清。（2）10％FZHY含药血清干预LX2、LO2和BRL3A细胞，CCK8检测细胞增殖。（3）10％FZHY含药血清干预活化LX2细胞后，Western blot 检测 c-Myc、α-SMA、COL1A2、P-GSK3β、GSK3β、β-catenin、RXRα、SFRP1 和 CCND1 的表达;RT-qPCR 检测 miR-27a 的表达。 结果: 1.细胞实验:（1）miR-27a在活化的LX2和T6细胞中表达增加（P＜0.05）miR-27a抑制剂可以抑制LX2细胞增殖（P＜0.05），miR-27a模拟物可以促进LX2 细胞增殖（P＜0.05）;miR-27a 模拟物增加 LX2 中 α-SMA、COL1A2、P-GSK3β和PPARγ的表达（P＜0.05），miR-27a抑制剂则呈现出相反的效果（P＜0.05）;（2）c-Myc抑制剂和c-MycsiRNA下调c-Myc的表达，同时也下调miR-27a的表达（P＜0.05），敲减c-Myc下调LX2细胞及TGF-β1诱导活化的LX2细胞中COL1A2的表达。 2.动物实验:（1）与模型组比较，FZHY干预可以改善DMN肝纤维化大鼠的整体情况，升高肝纤维化大鼠的肝、肝、肾质量、肝体比（P＜0.05），降低肝纤维化的脾体比、腹水体积（P＜0.05）。（2）与模型组比较，FZHY干预改善了大鼠肝组织组织病理学情况及胶原沉淀;降低了大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBA、TBIL及肝组织中α-SMA、COL1A2和Hyp的表达（P＜0.05）。（3）与模型组比较，FZHY干预降低了大鼠血清中miR-27a的表达，降低了肝组织中c-Myc、P-GSK3β、β-catenin、CCND1 的表达（P＜0.05），升高了肝组织中 FOXO1、GSK3β、PPARγ、P-β-catenin、RXRα和 SFRP1 的表达（P＜0.05）。 3含药血清实验:（1）与10％HC组比较，10％HH含药血清抑制LX2细胞增殖（P＜0.05），促进BRL3A和LO2细胞增殖（P＜0.05）。（2）与10％HC组比较，10％HH可以拮抗TGF-β1对LX2细胞中COL1A2和α-SMA的升高作用（P＜0.05），降低活化LX2细胞中c-Myc及miR-27a的表达（P＜0.05），降低β-catenin、P-GSK3β 和 CCND1 的表达（P＜0.05），增加 SFRP 1 和 RXRα 的表达（P＜0.05）。 结论: 1.miR-27a在活化的HSC中表达升高,促进HSC的增殖及活化;miR-27a可以激活Wnt//β-catenin信号通路的;抑制c-Myc的表达可以下调miR-27a的表达，同时可以抑制LX2细胞增殖及COL1A2的表达;因此推测c-Myc/miR-27a/Wnt/β-catenin信号通路可以促进HSC活化。 2.FZHY可以呈剂量依赖地改善DNM诱导的大鼠肝纤维化，降低肝组织中c-Myc及血清中miR-27a的表达，同时抑制肝组织中Wnt/β-catenin信号通路的激活。 3.FZHY含药血清可以抑制HSC增殖及活化，降低c-Myc及miR-27a的表达，同时抑制HSC中Wnt/β-catenin信号通路的激活，因此FZHY通过c-Myc/miR-27a/Wnt/β-catenin信号通路抑制HSC激活，从而发挥其抗肝纤维化的作用。
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