摘要
目的: 通过临床研究验证芪榔方治疗气阴两虚型功能性便秘的有效性和安全性;通过网络药理学方法初步探索芪榔方靶向Cajal间质细胞（ICC）治疗功能性便秘的潜在作用机制;通过基础实验探究芪榔方对复方地芬诺酯便秘模型大鼠的通便效果及结肠ICC的影响，从SCF/C-kit-PLCγ1-IP3R/RyR信号轴角度探讨芪榔方治疗便秘大鼠的作用机制。 方法: 1、芪榔方治疗气阴两虚型功能性便秘患者的随机对照试验 纳入自2023年1月起至2023年9月于上海中医药大学附属市中医医院脾胃病科门诊接受治疗的气阴两虚型功能性便秘患者80例，随机分为试验组和对照组各40例，分别给予芪榔方和莫沙必利治疗8周，治疗后随访8周。主要疗效指标为临床有效率，次要疗效指标为每周平均完全自主排便次数（CSBM）、每周平均自主排便次数（SBM）、便秘主要症状总分、便秘主要症状各项评分、气阴两虚中医证候积分、PAC-QOL评分、SAS评分和SDS评分。 2、基于单细胞公共数据探讨芪榔方靶向Cajal间质细胞相关靶点治疗功能性便秘的潜在作用机制 运用UPLC-MS/MS技术分析芪榔方主要活性成分，结合TCMSP、ITCM和Herb数据库等平台，鉴定芪榔方中的主要活性成分及其作用靶点。从GEO数据库获取单细胞转录组公共数据，从中提取ICC相关靶点。在GeneCards数据库中检索关键词“Functional constipation”筛选出功能性便秘的疾病靶点。将芪榔方活性成分靶点、ICC相关靶点和功能性便秘靶点取交集获得芪榔方靶向ICC治疗功能性便秘的靶点集合。将上述交集靶点导入STRING数据库获取蛋白质互作网络，利用Cytoscape3.7.1得到“中药-成分-靶点”的网络图。使用KOBAS数据库进行GO和KEGG通路富集分析。运用AutoDock Vina软件将筛选的关键靶点和芪榔方潜在活性成分进行分子对接。 3、芪榔方调节SCF/C-kit-PLCγ1-IP3R/RyR信号轴修复结肠Cajal间质细胞治疗便秘的作用机制研究 随机将52只Wistar大鼠分为空白组10只和造模组42只。运用复方地芬诺酯灌胃造模法造模14天。每组取2只大鼠处死，通过粪便含水率、首粒黑便排出时间、肠道推进率等情况判定造模成功后，随机将造模组分为模型对照组（MC组）、低剂量芪榔方组（LQLF组）、中剂量芪榔方组（MQLF组）、高剂量芪榔方组（HQLF组）和莫沙必利组（PC组），每组各8只，给与对应药物灌胃2周。观察各组大鼠的体重、粪便含水率、首粒黑便排出时间，检测肠道推进功能。取结肠组织，HE染色观察病理形态，透射电镜观察ICC超微结构，Elisa检测血清AChE、VIP、SP、5-HT、MTL、GAS 含量;RT-PCR 检测 C-kit、SCF、PLCγ1、IP3R、RyR、5-HT4R、CX43 mRNA 的表达水平;Western-Blot 检测 C-kit、SCF、PLCγ1、IP3R、RyR、5-HT4R、CX43的表达水平;免疫荧光双标染色Ki-67、C-kit,观察ICC增殖活性。 结果: 1、芪榔方治疗气阴两虚型功能性便秘患者的随机对照试验 试验组和对照组各完成40例，均无明显不良反应。经2周治疗后，试验组临床有效率90％,对照组67.5％（P＜0.05）;经8周治疗后，试验组临床有效率92.5％,对照组72.5％（P＜0.05）。治疗2周后，试验组便秘主要症状总分较对照组降低2.2分（P＜0.001）;治疗8周后，试验组便秘主要症状总分较对照组降低2.6分（P＜0.001）;治疗结束后随访2周，试验组便秘主要症状总分较对照组降低2.175分（P＜0.001）;治疗结束后随访8周，试验组便秘主要症状总分较对照组降低2.45分（P＜0.001）。治疗2周后和治疗8周后试验组中医各项主症评分均低于对照组（P＜0.05）。治疗2周后试验组中医次症评分除纳呆和心烦不眠外，其余各症均优于对照组（P＜0.05）;治疗8周后试验组中医次症评分除心烦不眠外，其余各症均优于对照组（P＜0.05）。随着治疗时间的延长，2组平均每周CSBM均有增加，且试验组较对照组增加幅度更大。治疗2周后，试验组平均每周CSBM较对照组增加0.275次，差异无统计学意义（P=0.246）;治疗8周后，试验组平均每周CSBM较对照组增加0.725次（P＜0.05）;治疗结束后随访2周，试验组平均每周CSBM较对照组增加0.8次（P＜0.01）;治疗结束后随访8周，试验组平均每周CSBM较对照组增加0.75次（P＜0.01）。治疗2周后，试验组平均每周SBM较对照组增加0.525次;治疗8周后，试验组平均每周SBM较对照组增加0.65次（P＜0.05）;治疗结束后随访2周，试验组平均每周SBM较对照组增加0.625次（P＜0.05）;治疗结束后随访8周，试验组平均每周SBM较对照组增加0.65次（P＜0.05）;不同测量时间点的SBM差异具有统计学差异（P＜0.001），随着治疗时间的增长，各治疗节点与治疗前相比，均数差逐渐增大，随着治疗结束，均数差增大的幅度有所下降（P＜0.05）。治疗2周后和治疗8周后试验组生活质量评分均优于对照组（P＜0.05）。试验组SDS评分和SAS评分在治疗后8周明显降低，且优于对照组（P＜0.05）。 2、基于单细胞公共数据探讨芪榔方靶向Cajal间质细胞相关靶点治疗功能性便秘的潜在作用机制 通过UPLC-MS/MS技术鉴定出芪榔方中19个主要活性成分，其中黄酮类化合物12种，萜类化合物2种，酚类化合物3种，蒽醌类化合物1种，其他化合物1种。从Herb、ITCM数据库以及手动检索中去除重复后获得了 3784个芪榔方药物靶点，从单细胞转录组测序数据中筛选出了 781个与ICC相关的靶点，在Genecards数据库中查询到了 5833个与功能性便秘相关的靶点。三者交集后，共获得了 89个芪榔方靶向ICC治疗功能性便秘的靶点。将上述靶点上传至STRING数据库构建PPI网络，运用cytoHubba插件的算法筛选获得KIT、SOS1、IRS1、ANO1和MITF 5个核心靶点。GO功能富集分析发现交集靶点主要富集在调节细胞膜（plasma membrane）、钙离子结合（calcium ion binding）、钙依赖性蛋白激酶C活性（calcium-dependent protein kinase C activity）、细胞群体增殖的正调控（positive regulation of cell population proliferation）以及凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）这些生物学功能;KEGG通路富集分析发现主要与PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路和Jak-STAT信号通路等通路相关。分子对接显示，KIT与白术内酯Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ）和芹菜素（Apigenin）的亲和力最强（-7.9 kcal/mol）,其次是异鼠李素（Isorhamnetin）、刺芒柄花素（Formononetin）、芒柄花苷（Ononin）和柚皮素（Naringenin）（-7.8 kcal/mol）。 3、芪榔方调节SCF/C-kit-PLCγ1-IP3R/RyR信号轴修复结肠Cajal间质细胞治疗便秘的作用机制研究 相较于模型对照组，中剂量芪榔方组和高剂量芪榔方组体重增长加快（P＜0.01）,各治疗组24h粪便粒数、粪便含水率、肠道推进功能均有显著增加（P＜0.05）,首粒黑便时间均有缩短（P＜0.05）。HE染色显示高剂量芪榔方组结肠腺体排列较整齐，杯状细胞增多，炎症细胞浸润减少，黏膜层和肌层厚度依次呈增厚趋势。透射电镜显示模型对照组ICC细胞出现线粒体肿胀和自噬现象，部分粗面内质网明显扩张;经芪榔方治疗后，ICC细胞恢复了一些结构完整性，但胞浆中多数线粒体已发生轻度肿胀，亦可见少量自噬体。与模型对照组相比，各组大鼠血清VIP均有所下降（P＜0.05）;在AChE和SP方面，中剂量芪榔方组和高剂量芪榔方组较模型对照组有所增加（P＜0.05）。与模型对照组相比，各组大鼠血清5-HT、MTL、GAS含量均有增加（P＜0.05）。与空白对照组比较，模型对照组5-HT4R、CX43、SCF、C-kit、PLCγ1、IP3R、RyRmRNA表达降低（P＜0.05）;相较于模型对照组，各组C-kit和RyR mRNA表达有增加趋势（P＜0.05），中剂量芪榔方组、高剂量芪榔方组和莫沙必利组5-HT4R、CX43、SCF、PLCγ1和IP3RmRNA表达增加（P＜0.05）。与莫沙必利组比较，高剂量芪榔方组SCF和C-kitmRNA表达增加（P＜0.01）。与空白对照组比较，模型对照组5-HT4R、CX43、SCF、C-kit、PLCγ1、IP3R、RyR蛋白表达均降低（P＜0.05）;相较于模型对照组，各组SCF、RyR、IP3R蛋白表达有增加趋势（P＜0.05），中剂量芪榔方组、高剂量芪榔方组和莫沙必利组5-HT4R、CX43、C-kit、PLCγ1蛋白表达增加（P＜0.05）。与空白对照组相比，模型对照组处于增殖状态的Ki67+的ICC细胞显著减少（P＜0.05）;与模型对照组相比，高剂量芪榔方组处于增殖状态的Ki67+的ICC细胞显著增多（P＜0.05）。 结论: 1、芪榔方能够有效地缓解气阴两虚型功能性便秘患者的便秘主要症状，增加患者平均每周CSBM和SBM次数，提高患者的生活质量，改善患者不良情绪，且无明显不良反应。 2、网络药理学研究发现芪榔方通过多成分、多靶点、多途径治疗便秘。C-kit是芪榔方靶向ICC细胞治疗便秘的核心靶点。芪榔方主要活性成分可以很好地和C-kit结合。 3、芪榔方可以改善复方地芬诺酯便秘模型大鼠的便秘症状，增加粪便量和粪便含水率，缩短首粒黑便排出时间，增强肠道推进功能，改善胃肠激素和神经递质,促进复方地芬诺酯便秘模型大鼠结肠ICC细胞形态修复，提高5-HT4R和CX43表达。 4、芪榔方可能通过激活SCF/C-kit-PLCγ1-IP3R/RyR信号轴，增强细胞增殖活性，促进ICC细胞增殖和功能修复，进而恢复复方地芬诺酯便秘模型大鼠结肠动力，改善便秘症状。
NETL