摘要
背景 FLAURA研究表明奥希替尼一线治疗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）突变型晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）疗效卓越，但真实世界中的疗效及安全性尚待证实，其疗效和EGFR 19外显子缺失不同亚型的关系仍不明确。此外，奥希替尼耐药难以避免，与一线奥希替尼疗效或耐药相关肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment,TIME）单细胞水平空间异质性有待破译。本研究旨在全面评估奥希替尼一线治疗的疗效和安全性，并深入探讨不同EGFR 19外显子缺失亚型对奥希替尼疗效的影响。同时致力于探索空间水平TIME在奥希替尼一线治疗疗效和耐药机制方面的作用，以期为未来EGFR突变NSCLC的治疗提供新的治疗策略。 方法 本研究针对EGFR突变NSCLC患者进行了如下探索:（1）从CAPTRA-Lung数据库中纳入1556名EGFR突变的Ⅲc-Ⅳ期NSCLC患者。所有患者均一线接受奥希替尼（n=202）或第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）（n=1354）治疗。通过 1∶2 的倾向性评分匹配（propensity score matching,PSM）调整两组基线特征的差异，并比较奥希替尼及一代EGFR-TKIs疗效及安全性。（2）从CAPTRA-Lung数据库中纳入106例Ⅲb-Ⅳ期EGFR 19del且接受奥希替尼一线治疗的NSCLC患者，比较不同亚型患者接受奥希替尼一线治疗疗效的差异。（3）从一线接受奥希替尼治疗的317名EGFR突变NSCLC患者中筛选出12名无进展生存期（progression-free survival,PFS）长（≥30月）和10名短（≤12月）的患者，对其组织样本进行成像质谱流式（imaging mass cytometry,IMC）检测。（4）通过分析奥希替尼耐药的EGFR突变肺腺癌细胞系、一线奥希替尼耐药前后配对样本的转录组测序数据及IMC检测结果，探索奥希替尼耐药后细胞系表型、组织样本免疫浸润及各种细胞频率及空间特征的改变。 结果 （1）PSM后，202名一线接受奥希替尼和404名接受一代EGFR-TKI治疗的患者被纳入最终分析。奥希替尼组的中位PFS为19.4个月（95％置信区间[confidence interval,CI]:14.3-24.4），中位总生存期（overall survival,OS）为40.5个月（95％CI:27.1-54.0）,较对照组显著延长，安全性相当。（2）奥希替尼一线治疗疗效与19del亚型突变频率（常见的E746-A750del突变或其他不常见的亚型）、缺失起始密码子（E746或L747）以及缺失核苷酸的数量（15个核苷酸或非15个核苷酸)之间没有明显关联。(3)长PFS组中肥大细胞浸润程度及其与多种免疫细胞以及肿瘤细胞的相互作用显著增多。(4)奥希替尼耐药后PC9细胞增殖能力、迁移能力、克隆形成能力显著增强，CD47及细胞程序性死亡-配体 1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)mRNA 水平增加;组织样本TIME中各种免疫细胞浸润显著减少，肿瘤细胞及T细胞周围富集的肌成纤维细胞增多。 结论 真实世界中，奥希替尼一线治疗EGFR突变的晚期NSCLC患者疗效更佳，安全性良好，且对各种EGFR 19外显子缺失亚型均有良好疗效。肥大细胞的浸润及其与其他免疫细胞相互作用增多与一线奥希替尼疗效改善相关，提示肥大细胞可能是未来EGFR突变NSCLC治疗的潜在细胞靶点。此外，TIME中细胞频率及空间关系改变在奥希替尼耐药中起到重要作用。 第一部分 EGFR突变阳性晚期NSCLC 一线奥希替尼治疗疗效与安全性的真实世界研究 背景 FLAURA研究显示，奥希替尼一线治疗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变型晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)无进展生存期(progression-free survival，PFS)、总生存期(overall survival,OS)更长，安全性相似，但亚洲患者获益不明确。真实世界中奥希替尼一线治疗的疗效及安全性尚待证实。 方法 本研究从CAPTRA-Lung数据库中纳入了 1556名自2010年1月1日至2022年10月31日诊断为EGFR突变的Ⅲc-Ⅳ期NSCLC患者。所有患者均一线接受奥希替尼(n=202)或一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)(n=1354)治疗。采用 1∶2 的倾向性评分匹配(propensity score matching，PSM)调整两组基线特征的差异。通过计算PSM前后的标准化均差(standardized mean differences,SMD)来检验两组之间协变量分布是否均衡。 结果 PSM后，202名一线接受奥希替尼和404名接受一代EGFR-TKI治疗的患者被纳入最终分析，每个匹配变量的SMD均小于0.10。奥希替尼组的中位PFS为19.4 个月(95％置信区间[confidence interval，CI]:14.3-24.4),对照组为 10.9个月(95％CI:9.3-12.5)(风险比[hazard ratio,HR]为 0.47;95％CI:0.38-0.59;P＜0.001)。两组患者的中位OS分别为40.5个月(95％CI:27.1-54.0)和34.3 个月(95％CI:30.6-38.0)(HR:0.76;95％CI:0.58-1.00;P=0.045)。两组的3级不良事件(adverse events，AEs)发生率分别为1％和4.2％。两组患者均未出现4级不良反应和与治疗相关的死亡病例。 结论 在真实世界中，奥希替尼作为EGFR突变的晚期NSCLC患者的一线治疗策略，可获得更长的PFS和OS，安全性与一代EGFR-TKIs相似。 第二部分 EGFR 19外显子缺失不同亚型和一线奥希替尼治疗敏感性的关系 背景 关于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)19 外显子缺失不同亚型和一线奥希替尼治疗敏感性关系的研究十分有限。 方法 本研究纳入了 CAPTRA-Lung数据库中106例Ⅲb-Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者，所有患者均通过二代测序(next-generation sequencing，NGS)证实存在EGFR 19外显子缺失突变，并接受奥希替尼一线治疗。根据突变频率(常见的E746-A750del突变或其他不常见的亚型)、EGFR 19外显子缺失的起始密码子(E746或L747)以及缺失核苷酸的数量(缺失15个核苷酸:15n-del或非15n-del)对患者进行分组，比较亚组的临床特征、客观缓解率(objective response rate,ORR)和无进展生存期(progression-free survival，PFS)。 结果 本研究共发现19种EGFR 19号外显子缺失突变亚型。其中，最常见的是E746_A750del,占 56.6％(n=60),其次是 L747_P753delinsS(9.4％，n=10)、L747_T751delinsP(6.6％,n=7)和 L747_A750delinsP(4.7％,n=5)。与 15n-del组相比，非15n-del组患者发生脑转移的概率更高(P=0.044)。奥希替尼一线治疗的ORR和PFS与突变频率、EGFR 19外显子缺失的起始密码子以及缺失核苷酸的数量之间没有关联。L747_A750delinsP组的中位PFS为12.3个月(95％置信区间[confidence interval,CI]:0.1-24.5),数值上短于 E746_A750del 组(24.3个月，95％CI:16.8-31.8),但未达到统计学意义(P=0.100)。 结论 不同的EGFR 19外显子缺失亚型对奥希替尼一线治疗的敏感性相当。 第三部分 一线奥希替尼治疗EGFR突变晚期NSCLC疗效与肿瘤免疫微环境相关性探索 背景 肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME)中各细胞之间复杂的相互作用在癌症进展中至关重要，也可能影响抗肿瘤治疗效果。然而，关于肿瘤免疫微环境和一线奥希替尼疗效关系的研究较少。 方法 本研究从317名一线接受奥希替尼治疗的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中筛选出无进展生存期(progression-free survival,PFS)长和PFS短的患者，采用成像质谱流式(imaging mass cytometry，IMC)方法量化福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)样本中38种蛋白质的亚细胞空间表达，比较其TIME的差异。同时，按照突变类型为19号外显子缺失(19del)或者21号外显子L858R点突变(21L858R)进行亚组分析。 结果 317 名患者的中位 PFS 为 18.7 月(95％置信区间[confidence interval，CI]:12.1-25.3月)，筛选后有12名长PFS(≥30月)和10名短PFS(≤12月)的患者被纳入最终分析。通过分析IMC检测得到的图像，本研究共聚类13个细胞簇，涵盖肿瘤细胞、免疫细胞及基质细胞。结果显示，长PFS组中肥大细胞浸润程度及其与B细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc)、辅助性T细胞(helper T cell,Th)、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞等多种免疫细胞以及肿瘤细胞的相互作用显著增加。此外，长PFS组M2型巨噬细胞及内皮细胞富集的邻域显著增多，而短PFS组肿瘤细胞富集的邻域显著增多。根据突变类型为19del或21L8585R点突变划分亚组分析结果显示，长PFS和短PFS肿瘤微环境的差异和总体人群基本一致。 结论 肥大细胞浸润及其与其他免疫细胞相互作用增多与一线奥希替尼疗效改善相关，肥大细胞可能是未来EGFR突变NSCLC治疗的潜在细胞靶点。 第四部分 一线奥希替尼治疗耐药前后肿瘤免疫微环境的变化探索 背景 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的获得性耐药可能与肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME)的改变有关。但现有研究主要从细胞频率上研究奥希替尼耐药前后TIME的变化，耐药前后TIME的单细胞空间异质性仍待探讨。 方法 本研究首先通过奥希替尼耐药的EGFR突变肺腺癌细胞系验证奥希替尼耐药后细胞系表型及免疫检查点CD47及细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)mRNA水平的变化;其次基于公共数据库中转录组测序数据，采用CIBERSORT算法比较一线奥希替尼耐药前后肺癌样本中免疫浸润的差异;最后通过成像质谱流式(imaging mass cytometry，IMC)方法对奥希替尼耐药前后的福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)样本进行空间蛋白组学分析，从单细胞水平描绘一线奥希替尼耐药前后TIME中各种细胞频率及空间特征。 结果 奥希替尼耐药后PC9细胞系增殖、迁移、克隆形成能力增强，CD47及PD-L1 mRNA水平增高。通过分析4对奥希替尼耐药前后的转录组测序数据(GSE165019)发现，奥希替尼耐药后样本中CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润减少。对奥希替尼耐药前后样本的IMC分析显示，奥希替尼耐药后样本各种免疫细胞浸润显著减少，包括辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞等适应性免疫细胞以及树突状细胞、经典型单核细胞等先天性免疫细胞。此外，肿瘤细胞及T细胞周围富集的免疫细胞也显著减少，而肌成纤维细胞显著增多。 结论 奥希替尼耐药后，肿瘤组织中免疫细胞浸润减少，肿瘤细胞及T细胞周围富集的肌成纤维细胞增多。TIME中细胞频率及空间关系改变在奥希替尼耐药中起到重要作用。
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