摘要
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的高度接触性传染病，其宿主包括牛、羊、猪等偶蹄动物。FMDV是单股、正链RNA病毒，属于微RNA病毒科、口疮病毒属。FMDV包括O型、A型、C型、SAT1-3型和Asia1型共7种血清型，不同血清型间不产生交叉免疫保护。FMDV存在广泛的抗原变异，各血清型都包含众多基因亚型。目前，在口蹄疫防控工作的关键是快速准确地诊断和使用有效的疫苗。 本研究采用纯化的O型和A型FMDV病毒抗原免疫健康6周龄BALB/c小鼠，采用间接ELISA和间接免疫荧光（IFA）方法进行三轮筛选鉴定与亚克隆，成功制备了 2株杂交瘤细胞株,命名为3D9和6C9,抗体亚类均为IgG1/κ亚类。经间接ELISA检测，2株杂交瘤细胞上清的抗体效价分别为1∶6.4×103和1∶1.28×104，腹水抗体效价分别为1∶105和1∶106;硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数分别为2.5mol/L和3mol/L;经IFA鉴定，单抗3D9为A型、O型和Asia1型共享单抗;单抗6C9为A型特异性单抗。经Western blot分析表明:单抗3D9和6C9所针对的表位均为构象表位。病毒中和试验（VNT）表明:单抗3D9无中和活性，单抗6C9的抗体中和效价为1∶4096。这2株单克隆抗体的成功制备为FMDV诊断技术研究提供了重要的实验材料。 单抗3D9是一株识别A型、O型和Asia1型FMDV共享型构象表位的单抗，单抗6C9是一株识别A型FMDV特异性构象表位的中和性单抗。为确定FMDV抗原表位的性质，本研究对单抗3D9和6C9识别的表位进行鉴定和定位。利用噬菌体随机12肽库对单抗3D9进行3轮生物淘选，利用噬菌体ELISA和抗原竞争抑制试验检测，获得12个与单抗3D9均发生特异性反应阳性噬菌体克隆;序列测定及比对分析显示，4个噬菌体克隆展示多肽的共有基序为GVYxxAYxW（x代表任意氨基酸），初步认定为单抗3D9识别的模拟表位;通过与FMDV的7个血清型不同毒株的氨基酸序列进行比对发现，单抗3D9模拟表位与VP2蛋白序列89GVYxxxxxxxAYxxxxW105高度同源，且该序列在各血清型FMDV毒株间高度保守，表明单抗3D9表位是FMDV位于VP2蛋白的高度保守性表位;为进一步验证单抗3D9表位，利用反向遗传技术成功拯救了 O型FMDV O/YS/CHA/05的表位V90A突变株，经双抗体夹心ELISA检测表明，V90氨基酸残基对单抗3D9表位的活性起重要作用。采用相同策略确定，与单抗6C9发生特异性反应的噬菌体克隆展示多肽的共有基序为YxxPxGDLG;通过与A型FMDV不同拓扑型毒株的氨基酸序列进行比对发现，单抗6C9表位与VP1蛋白上的G-H环135YxxPxxxxxGDLG147高度同源，而且该序列在A型FMDV毒株之间高度保守，表明单抗6C9表位是A型FMDV位于VP1蛋白的高度保守的中和表位;为进一步验证单抗6C9表位，利用反向遗传技术成功拯救A型FMDV A/XJBC/CHA/2010的表位P138A和G144A突变株，经病毒中和试验和双抗体夹心ELISA检测表明，P138和G144氨基酸残基对单抗6C9表位的活性起重要作用。 总之，本研究在制备口蹄疫病毒单抗的基础上对其识别的表位进行鉴定与定位。经鉴定，单抗3D9识别的表位是位于VP2蛋白上的7个血清型FMDV共享的构象表位，而单抗6C9识别的表位是位于VP1蛋白G-H环上的A型FMDV特异的构象型中和表位。这些研究将为FMDV开发诊断试剂和设计新型疫苗提供理论基础和实验依据。
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