摘要
背景与目的:结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因。其中直肠癌占结肠癌患者数中的30％。已有研究证实，对结直肠癌患者进行放疗能显著提高临床治疗效果。然而，放疗的临床效果常受限于患者固有的放射抵抗性。此外，放化疗的疗效及治疗过程常受到副作用的制约和影响。我们前期研究发现miR-4274 rs 1553867776影响直肠癌患者术后同步放化疗生存,且miR-4707-3p rs2273626影响直肠癌患者放化疗后的骨髓抑制副反应。本研究承接之前的研究针对这两个生物标志物进行了深入的机制研究，分析了先前影响直肠癌放化疗患者生存的miR-4274 rs1553867776 SNP位点的机制，并进一步揭示了 miR-4707-3p rs2273626 SNP位点如何影响直肠癌患者接受放化疗后出现骨髓抑制副作用的机制。 方法:本研究采用细胞活力测定、克隆形成实验等技术手段，探讨miR-4274在结肠癌细胞生长中的作用，并研究不同rs1553867776类型的miR-4274在放射治疗中的功能。通过对转染了 miR-4274模拟物和抑制剂的细胞进行放疗前后蛋白质的收集，并进行免疫印迹分析，以验证其对DNA损伤修复功能的影响。利用数据库预测miR-4274的潜在靶基因PEX5,并构建含有靶基因3'非翻译区结合位点的质粒，通过双荧光素酶报告基因实验探究miR-4274与PEX5的相互作用，发现rs1553867776变体影响miR-4274与PEX5的结合。通过免疫印迹分析，验证miR-4274表达变化如何影响PEX5蛋白水平。构建PEX5稳定过表达和敲除的细胞系，研究其对细胞增殖及过表达PEX5的影响。对PEX5稳定敲除细胞系进行全转录组测序，分析差异表达基因，并通过基因集富集分析探讨PEX5调控的信号通路。采用彗星实验、免疫印迹和免疫荧光实验，分析PEX5对DNA损伤的影响，并通过免疫共沉淀实验探究PEX5与Ku70蛋白的相互作用。利用细胞核质分离后的免疫印迹实验验证放疗后PEX5对Ku70在细胞内定位的影响。进一步通过一系列实验探究PEX5在放疗引发的铁死亡中的角色。通过小鼠皮下成瘤实验验证miR-4274通过其靶基因PEX5在体内促进肿瘤生长和放疗抵抗的作用。此外，采用细胞活力测定、克隆形成实验等方法研究miR-4707-3p在结肠癌中的作用，通过数据库分析和双荧光素酶报告基因实验验证了 miR-4707-3p的靶基因NCKAP1L,并通过多种数据库探讨NCKAP1L对肿瘤浸润和骨髓抑制的影响。 结果:我们的研究揭示了 miR-4274通过靶向PEX5 mRNA发挥促进肿瘤生长和增强放疗抵抗的作用。特别是，miR-4274种子区rs1553867776的多态性通过影响与靶基因mRNA的结合，进而在转录后水平调控PEX5表达。PEX5通过与Ku70的相互作用，干预了放疗后Ku70向细胞核的迁移，进而抑制了 Ku复合体的形成和放疗后DNA损伤的修复过程。此外，PEX5还参与了放疗诱导的铁死亡过程。同时，我们还发现miR-4707-3p通过靶向NCKAP1LmRNA影响放疗后的骨髓抑制反应，其中miR-4707-3p种子区rs2273626的多态性调控了miR-4707-3p的表达及其与靶基因mRNA的结合。NCKAP1L的调节作用影响骨髓造血干细胞功能及肿瘤的免疫浸润。 结论:本研究首次阐明了 miR-4274 rs1553867776变异在调控直肠癌放射敏感性中的分子机制及其重要作用，确立PEX5作为miR-4274的直接靶标。miR-4274 rs1553867776 变异通过影响 miR-4274 与 PEX5 mRNA 的结合，调节PEX5蛋白表达，其中PEX5的增表达不仅提升了放射敏感性，还促进了由电离辐射引发的铁死亡，这为提高直肠癌患者的放射敏感性提供了新的策略。此外,本研究揭示了 miR-4707-3p种子区rs2273626的多态性及其对肠癌治疗后骨髓抑制副反应的影响，为直肠癌患者的个性化治疗提供了重要的理论基础和新的研究方向。
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