摘要
本研究对分离自我国东北地区主栽大豆品种的大豆根瘤菌及部分参比菌株进行了遗传多样性与系统发育分析，选取代表菌株进行适中低温菌株筛选，进一步采用蛋白质组学技术对所筛菌株的生长机理进行了初步探索。本研究对揭示该地区大豆根瘤菌的种群分布与遗传多样性，探索适中低温菌株生长及结瘤固氮能力差异的机理均有重要意义。全文结论如下: 从东北地区14个地点采集18个品种的大豆根瘤347份，通过分离、纯化和回接验证获得312株大豆根瘤菌。采用 BOX-PCR、IGS PCR-RFLP、16S rDNA PCR-RFLP 和 16S rDNA 基因序列分析法对所得菌株及参比菌株进行分析，从中选出42个代表菌株进行遗传多样性和系统发育研究。结果表明，供试菌株均为大豆慢生根瘤菌，以Bradyrhizobium japonicum为优势种;在IGS PCR-RFLP 72％和16S rDNA PCR-RFLP 76％相似性水平上，供试菌株可分别被分为6和4个群;在BOX-PCR 90％相似性水平上，供试菌株可被分为31个群，表明东北地区大豆慢生根瘤菌具有丰富的遗传多样性。综合分析后发现，供试菌株的遗传多样性与其地理来源有一定的相关性，而与宿主品种相关性不明显。 根据来自黑龙江省大豆根瘤菌的遗传分型结果、宿主品种和地理来源，选取29株代表菌株及参比菌株B.japonicum USDA 110进行适中低温优良菌株筛选，结果发现，供试菌株在6℃、13℃、17℃的中低温条件下的生长能力存在很大差异，筛选获得适中低温（6℃～17℃）菌株21株。再以黑河53为宿主，进行中低温蛭石盆栽试验，通过测定植株地上干重和含氮量、根瘤数量和干重获得1株在中温（15℃）条件下生长较好且结瘤固氮效率较高的菌株B.japonicum 5438。 以B.japonicum 5438和在中低温条件下生长较好但结瘤固氮能力较差的菌株B.japonicum 5411为研究对象，探索适中低温菌株生长及结瘤固氮能力差异的分子机理。根据两株菌在15℃和28℃时的生长曲线，将两株菌在15℃和28℃下分别培养12 d和72 h,使细胞处于对数期，然后进行蛋白质组学分析。结果发现，5411在15℃下其总蛋白质与28℃相比，存在42个差异蛋白，其中，上调或诱导表达的蛋白点15个，下调或阻抑表达的蛋白点27个;经MOLDI-TOF质谱分析，鉴定了 33个差异蛋白，其中25个功能已知。同样，与28℃生长条件相比，5438在15℃条件下，其差异蛋白有46个，其中，上调或诱导表达的蛋白点16个，下调或阻抑表达的蛋白点30个;经分析，30个蛋白点得到了鉴定，其中21个功能已知。 对差异蛋白进行后发现:与28℃相比，两株菌在15℃下生长时，参与能量与合成代谢的蛋白表达下调，其中，5411中苹果酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶亚基生物素羧基载体蛋白和氧化还原酶阻抑表达;5438中电子转移黄素蛋白大亚基、苹果酸脱氢酶和脱氧尿苷5'-三磷酸核苷酸水解酶表达下调。两株菌在15℃下生长时保护细胞免受氧损伤的蛋白表达下调，协助前蛋白折叠的蛋白表达上调，表明菌株此时面对的氧化压力下降，但新生多肽的折叠受到更多干扰。 两株菌在中温（15℃）生长时，除了产生上述蛋白响应外，还表现出不同的应对策略:在15℃下生长时，5411中醛脱氢酶、肌醇单磷酸酶家族蛋白和氮调节蛋白PⅡ表达下调，而438中乙酰辅酶A乙酰基转移酶和RNA聚合酶σE因子表达上调;这可能是最终导致5438比5411具有更高的中低温结瘤固氮效率的关键因子。
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