摘要
黏附是微生物定植于宿主肠道过程中的第一步。只有黏附于宿主肠道细胞上，才能保证微生物在宿主肠道内长期发挥作用。因此，黏附能力成为从乳酸菌中筛选益生菌株的必要条件。在水产养殖中，乳酸菌的黏附能力显得尤为重要。 为了研究乳酸菌的黏附效应及肠道的局部免疫应答，我们建立了罗非鱼肠道的离体肠囊培养模型，经 PCR-DGGE 及电镜观测分析显示，Lactobacillus plantarum subsp.JCM 1149T和 Aeromonas hydrophila NJ-1可以较好的黏附于该模型上。另外电镜观察还表明肠囊模型的组织形态保持完整，结合对肠囊组织肌动蛋白(β-actin)表达量变化的分析结果表明，肠囊模型的组织活性良好。这些数据表明，以离体肠囊作为模型对乳酸菌黏附进行深入研究的可行性。该模型是首次在温水鱼中尝试的肠囊离体实验，为快速廉价筛选鱼类益生菌建立了可行性方案，避免动物生物学试验造成的高价格与长时间的弊端，具有重要的应用价值。 本实验室以前研究表明L.plantarum subsp.JCM 1149T是罗非鱼肠道中的强定植菌株。在此，我们使用高效快捷的肠囊模型研究了乳酸菌在罗非鱼肠囊中的黏附效应及肠囊模型的局部免疫应答机制。实验取罗非鱼的前肠和后肠分别制备成肠囊，以PBS缓冲液处理组为实验对照组(CK),设置以 L.plantarum subsp.JCM 1149T(109 CFU/mL)处理的 A 组、A.hydrophila NJ-1(108 CFU/mL)处理的B组及两个菌株先后处理的C组三个实验组。PCR-DGGE及肠道定植菌株计数分析结果显示:与后肠相比，L.plantarum subsp.JCM 1149T和A.hydrophila NJ-1均更倾向定植于前肠;并且这两种菌株在前或后肠中都显示出了对彼此黏附的相互抑制，表明两株菌株间存在着竞争黏附效应。此外，细胞因子HSP70、IL-1β和TNF-α表达量的研究同样证实前肠肠囊的局部免疫应答效应优于后肠肠囊的。与后肠相比，前肠肠囊表现出了高的菌株黏附能力和敏感的免疫应答效应，说明前肠和后肠在益生菌-致病菌-宿主互作机制中存在着不同的应答模式。扫描电子显微镜观测显示A.hydrophila NJ-1能够对前肠肠囊造成损毁，而L.plantarum subsp.JCM 1149T可以减轻这种损毁，这也证明了乳酸菌的益生效应。同时，我们也观察到了乳酸菌在肠道中的黏附。以上的实验结果表明，乳酸菌的黏附不但可以抑制致病菌的侵染，也可以增强肠道的局部免疫应答效应。 生物膜的形成是乳酸菌黏附能力的重要评判标准。为进一步研究乳酸菌的黏附效应，我们以生物膜形成能力强弱和编码菌毛蛋白spaABC基因的情况来评价L.rhamnosus CICC 6141、L.acidophilus JCM 1132T、L. casei CGMCC 1.2435、L.casei BL23、L.plantarum subsp.JCM 1149T、L.rhamnosus 20300等实验室保存的乳酸菌株。结果表明，L.rhamnosus CICC 6141可以形成致密的网状生物膜结构并具备spaABC编码基因。再通过异硫氰酸荧光素(FITTC)标记的L.rhamnosus CICC 6141进行斑马鱼肠道黏附实验，表明该菌株具有较强的肠道黏附能力。 为了进一步研究菌毛蛋白与乳酸菌黏附的关系，乳酸菌与宿主相互作用的分子机制，以及菌毛蛋白在其中的作用，我们从L.rhamnosus CICC 6141中克隆获得了与其黏附密切相关的菌毛蛋白spaABC。表达纯化分别获得spaA、spaB和spaC菌毛蛋白。以斑马鱼ZF4细胞系为模型，分别与以上三个蛋白以及牛血清蛋白BSA(作为对照处理)进行培养。结果显示，与BSA处理相比，spaC蛋白作为菌毛的功能蛋白，可以显著地减缓由病原菌A.hydrophila NJ-1引起的细胞凋亡，spaB和spaC没有表现出明显效应，表明spaC蛋白能特异性对宿主产生益生效应。进一步对免疫应答的分析，对细胞TLR受体(Toll-like receptor)表达量的分析显示，在经spaC处理后，TLR8.2的表达量显著上调，NFκB及其下游靶基因TNFα(Tumor nacrosis α)的表达量显著升高，但myd88的表达量没有明显的变化。从这些数据推断，斑马鱼ZF4细胞对spaC的应答可能是通过NFκB信号通路实现的。这些研究结果显示，乳酸菌通过其菌毛蛋白spaC与宿主相互作用，对该领域的研究有重要的借鉴意义。宿主中与菌毛蛋白spaC相互作用的分子机制，有待进一步的研究。
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