摘要
卵巢未成熟畸胎瘤（ovarian immature teratoma , OIT）是起源于卵巢生殖细胞的恶性肿瘤，约占卵巢恶性生殖细胞肿瘤的的 35-38%，主要发生30岁以下的年轻女性及幼女，通过手术、化疗患者可以获得长期生存，但是其中仍有5%的患者出现了卵巢早衰、不孕，严重的影响患者的长期生存质量。从该类疾病发现至今的60余年间，针对卵巢未成熟畸胎瘤病因学研究极少。目前，最广为接受的观点是未知因素诱发卵母细胞发育异常导致孤雌激活，然而缺乏详细的证据和分子机制支持这一假说。 本课题组在临床工作中首次收集到2个卵巢未成熟畸胎瘤家系，结合其发病年龄较早、多个肿瘤同时发生的特点，提示遗传因素在OIT的发生过程中起到非常重要的作用。既往研究中显示，在具有遗传易感性的疾病中，通过家系病例的遗传背景分析更有利于寻找该类疾病的遗传易感基因/致病基因。因此本研究旨通过对2个家系成员外周血进行全外显子测序，对比分析患病人群和未发病人群的遗传背景差异，筛选OIT可能的致病基因，并通过体外实验深入研究所筛选出的BMP15基因在遗传性卵巢未成熟畸胎瘤发生中的相关机制，为后续卵巢未成熟畸胎瘤的分子遗传学研究提供理论依据。 第一部分卵巢未成熟畸胎瘤致病基因的筛选 目的：在家系成员中，通过全外显子测序与表型分析相结合筛选OIT潜在的遗传易感基因/致病基因，通过Sanger测序验证，完成家系谱绘制和变异位点的致病性评价 方法： 1、遵循医学伦理学要求，收集2个未成熟畸胎瘤家系成员及对照组外周血，提取DNA样本。 2、将家系成员DNA通过全外显子测序技术筛选家系致病基因及突变位点。随后Sanger测序验证初筛突变位点真实性，明确基因变异位点与临床表型的关系，绘制谱系图。 3、完成BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变的致病性预测。包括：再次验证核实突变人群分布频率、查询突变致病记录、完成保守性分析和共分离分析以及运用在线分析预测软件进行单核苷酸错义突变致病性分析。 结果： 1、全外显子测序结果显示两个家系中所有卵巢未成熟畸胎瘤患者均携带BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变；一代测序证实了上述突变的真实性。但是两个家系来源有所不同，家系1中系母系来源BMP15突变，家系2为父系来源BMP15突变。 3、人群数据库GnomAD、1000 Genomes、ExAC、TOPMed、ESP数据库中, BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变的人群频率均为低频罕见突变；临床突变数据库Clinvar及单核苷酸多态性数据库dbSNP中未见与BMP15 c.262C＞T错义突变相关疾病表型的登记及报道；UniProt保守性分析，结果证实在人类、恒河猴、牛、兔和马等10个物种间该位点高度保守；SIFT、PolyPhen-2、CADD在线软件对BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变预测结果均为致病性突变。 结论： 1、课题组首次收集并报道了两个卵巢未成熟畸胎瘤家系，通过家系成员的全外显子测序和生物信息学分析发现BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变，存在于2个家系中所有的OIT患者中，遗传背景分析呈X连锁显性遗传特征。经由家系谱系分析及共分离分析发现BMP15 c.262C＞T （p.R88C）错义突变与疾病在两个家系中呈共分离。 2、根据生物信息学预测，BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变导致蛋白功能受损，符合致病性突变，考虑为两个家系OIT发生的遗传易感基因/致病基因，为进一步研究该类疾病的发病机制提供了重要的理论依据，有待进一步体外细胞实验证实该结论。 第二部分 BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变后蛋白结构及表达水平的研究 目的：了解BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变对蛋白结构的影响及蛋白表达水平的改变情况 方法： 1、采用I-TASSER和PyMOL软件预测BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变导致的蛋白质三级结构的改变；scratch protein predictor和Cyscon软件预测突变是否会导致二硫键形成，从而影响蛋白质结构。 2、免疫组织化学检测OIT家系病例、散发OIT病例及正常卵巢组织中BMP15的表达。 3、构建BMP15野生型及突变型慢病毒载体，并稳定转染HEK-293T细胞构建稳转细胞系，随后Western-blot 方法检测 BMP15基因突变对蛋白表达水平的影响。 结果： 1、预测结果显示BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变会导致大量α螺旋和不规则卷曲产生，伴有异常二硫键形成，导致蛋白结构错误折叠，在后续蛋白加工过程中可能导致异常修饰和剪切，从而影响了蛋白质的表达量及功能，造成致病性结果。 2、采用免疫组织化学结果显示，BMP15蛋白表达定位于细胞膜和细胞质中，显微镜下呈棕黄色颗粒状分布。在OIT家系组BMP15的阳性表达率为25%（1/4），在30例散发OIT组BMP15阳性表达率为86.7%（26/30），在正常卵巢组织中BMP15的阳性表达率为93.3%（28/30）， BMP15蛋白在家系OIT病例组的阳性率明显低于正常卵巢组和散发OIT组，经Fisher检验，差异具有统计学意义（Fisher检验9.238，P＜0.01）。 3、成功构建BMP15野生型及突变型慢病毒转染HEK-293T细胞。Western blot 检测不同分组间细胞培养基上清中的分泌BMP15蛋白表达， BMP15 c.262C＞T（p.R88C）减少了BMP15蛋白的分泌，从而导致了突变组BMP15蛋白水平低于野生组。和野生组相比，突变组BMP15表达明显减低（84.7%），差异有统计学意义（P＜0.001）。 结论： BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变软件预测会引起蛋白结构的改变及异常二硫键形成，从而影响蛋白的三维结构，造成蛋白异常折叠，造成成熟蛋白量的减低；继而在体外试验中，证实与正常卵巢组织及散发OIT患者肿瘤组织相比，家系患者的肿瘤组织中BMP15表达减低，细胞实验也得到相同的结论。 第三部分 BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变与遗传性卵巢未成熟畸胎瘤发病的分子机制研究 目的：了解BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变对人卵巢颗粒细胞生物学行为的影响，及可能涉及的信号通路，明确该突变在遗传性未成熟畸胎瘤发病中的分子机制。 方法： 1、构建BMP15野生型及突变型慢病毒稳定转染COV434细胞系。 2、检测BMP15突变对与颗粒细胞生物学行为的影响包括：BMP15基因突变对人卵巢颗粒细胞系体外增殖活性的影响；流式细胞技术检测BMP15基因突变对颗粒细胞周期和早期凋亡的影响。 3、RNA-seq技术检测BMP15基因突变导致颗粒细胞转录组的变化，并通过Western-blot 方法检测组间筛选出的H-Ras/MAPK通路蛋白表达差异，以及免疫组织化学检测OIT家系病例、OIT散发病例及正常卵巢组织间H-Ras/MAPK通路蛋白表达差异。 结果： 1、BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变后后抑制了卵巢颗粒细胞cov434的增殖能力，诱发颗粒细胞发生G2/M期阻滞，细胞早期凋亡增加。 2、RNA-seq技术检测BMP15基因突变对颗粒细胞转录组的影响，在 H-Ras 和 MEK1 通路中同时富集，推测 BMP15 的突变可能抑制H-Ras/MAPK信号通路。 3、Western-blot 检测证实，BMP15基因突变显著降低了MEK1和H-ras的表达，同时降低了MEK1的磷酸化水平，差异均有统计学意义（P＜0.001）。 4、免疫组化结果证实MEK1/p-MEK1、H-ras蛋白在家系OIT组的阳性率明显低于散发OIT组，经Fisher检验，差异具有统计学意义（P＜0.05） 结论： 1、通过对COV434稳转细胞株的体外实验证实，BMP15 c.262C＞T （p.R88C）错义突变抑制了颗粒细胞的增殖，诱导凋亡增多。 2、RNA-seq技术检测提示突变组颗粒细胞中MAPK信号通路活性减低，并通过Western-blot、免疫组织化学予以证实。 3、发病机制的角度，我们发现OIT散发病例与OIT家系人群BMP15基因突变情况及及其对颗粒细胞生物学行为影响并不相同，提示发病机制的角度OIT可以分为散发型和遗传型，而BMP15可能是遗传性 OIT 的致病基因。 综上所述，本研究以临床发现的两个卵巢未成熟畸胎瘤家系研究为起点，通过对家系成员的外周血DNA进行全外显子测序及生物信息学分析，筛选出BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变，结合致病性分析，推测该胚系突变可能是OIT 的致病基因。随后通过体外试验细胞水平探寻了该突变在OIT发病过程中的可能机制。研究发现：1、两个家系中所有的OIT患者均携带BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变，但是两个家系来源有所不同，家系1中系母系来源BMP15突变，家系2为父系来源来源BMP15突变；2、软件预测BMP15 c.262C＞T（p.R88C）突变后，造成大量α螺旋和不规则卷曲产生，异常二硫键形成，可能影响后续蛋白加工过程造成蛋白质的表达量及功能。并通过 Western-blot 方法证实BMP15基因突变降低了BMP15蛋白的表达水平；3、通过细胞实验证实BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变造成人卵巢颗粒细胞的增殖减低，发生G2/M期阻滞，细胞早期凋亡增多。RNA-seq技术检测提示突变组颗粒细胞中MAPK信号通路活性减低，并通过Western-blot、免疫组织化学予以证实。从而提示了BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变在人卵巢未成熟畸胎瘤发生过程中的作用机制及可能影响的通路。回顾整个实验，加深了我们对于卵巢未成熟畸胎瘤发病机制的认识，对于后续的研究存在几点启示：1、通过家系谱分析我们可以看到BMP15 c.262C＞T（p.R88C）错义突变两个家系来源有所不同，家系1中系母系来源BMP15突变，家系2为父系来源来源BMP15突变，结合文献依据，不能排除OIT为多基因遗传疾病，除了BMP15作为主效基因外还有其他基因参与OIT发病；2、在第三部分的研究中我们发现，散发不携带BMP15突变的散发病例患者组织并未出现MAPK信号通路抑制，提示从发病机制的角度OIT可以分为散发型和遗传型，BMP15可能是遗传性OIT的致病基因；3、由于伦理及缺乏卵母细胞系，我们并未证实BMP15突变对卵母细胞的影响及如何诱导卵母细胞孤雌激活，有待后续体内动物实验证实。
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