摘要
性别控制技术在猪生产中具有巨大的经济价值，但目前尚未有可应用于养猪生产的性别控制技术。免疫学分选法分离 X 和 Y 精子简单易行，有望以简便、快速和低成本的方式实现猪性别控制。鉴定 X 精子和 Y 精子间差异或特异表达的膜蛋白质是开发免疫分选法的基础。目前，猪X和Y精子膜蛋白差异表达情况尚未清楚。因此，本文以猪X精子和Y精子为试验材料，通过DIA蛋白质组学、免疫荧光、western blot等技术鉴定猪 X 精子和 Y 精子间的差异膜蛋白，分析其主要的功能。本研究得到以下结果： 1. 本研究提取3头大白猪X精子和Y精子膜蛋白，使用DIA蛋白质组学技术共鉴定到6 777条肽段，对应的总蛋白质数量1 102个，得到可信蛋白1 067个；差异表达的蛋白360个，包括X精子组特异表达的蛋白9个和Y精子组特异表达的蛋白4 7个。 2. 通过生物学信息软件对鉴定到的差异蛋白进行富集分析。GO 分析结果显示：在生物过程上，它们显著富集在能量代谢和受精过程；在细胞成分分类上，它们显著富集在膜成分相关条目；在分子功能上，它们显著富集在GTP结合和内肽酶活性相关条目。KEGG通路富集显示它们显著富集在能量代谢相关的通路。 3. 随机挑选四个蛋白，使用 western blot 对蛋白组学数据进行验证，结果显示RALB和ARHGAP35在X精子显著高表达，PPP4C和CSNK2A2在Y精子显著高表达，与蛋白质组学检测结果相一致。免疫荧光显示RALB和PPP4C蛋白表达于精子尾部，ARHGAP35和CSNK2A2蛋白表达于精子头部。 4. 使用anti-RALB和anti-ARHGAP35孵育公猪精子，通过RT-qPCR鉴定X精子比例。结果显示1:200抗体稀释度组的上层精液X精子比例有所下降，与预期相符合，但差异不显著。 5. 使用细胞免疫荧光染色研究TLR7/8蛋白在猪、小鼠和牛精子的表达情况，结果显示TLR7/8蛋白在小鼠和牛的部分精子中特异性表达，在猪X精子和Y精子中都有表达且表达模式没有显著差异。使用RT-qPCR以及免疫组织化学染色研究TLR7/8在公猪睾丸和附睾的表达情况，结果显示TLR7/8在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾以及精子都有表达，TLR7在睾丸相对表达水平高于附睾（Plt;0.05）；TLR7/8在睾丸表达于生殖细胞，在附睾中表达于微绒毛以及管腔内的精子。 综上所述，通过DIA蛋白质组学、免疫荧光、western blot等技术筛选出猪X精子和Y精子间的差异膜蛋白RALB、ARHGAP35、PPP4C和CSNK2A2，使用1:200抗体稀释度孵育精液，上层 X 精子比例有所下降，在小鼠和牛 X 精子特异表达的TLR7/8蛋白在猪X和Y精子中表达模式没有显著差异。
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