摘要
研究背景:肠道菌群能调节机体代谢、免疫反应等，其失常与寻常痤疮等皮肤疾病密切相关，但目前尚无瘢痕疙瘩与肠道菌群紊乱的关联性研究。本研究拟探索瘢痕疙瘩与正常对照人群肠道菌群、相关代谢物的差异以及瘢痕与皮肤菌群的差异，并构建动物瘢痕模型，观察不同干预状态下瘢痕增生程度、肠道菌群、代谢的改变，寻找肠道-代谢物-瘢痕轴。 研究方法: 1.纳入从2022年到2023年的瘢痕疙瘩手术患者25例（K组）和无病理性瘢痕的手术患者（N组）10例，收集粪样、血样行非靶代谢组检测，粪样行宏基因组测序，粪样和收集的瘢痕疙瘩组织（K-KD组）、瘢痕疙瘩周围正常皮肤（K-NS组）和N组正常皮肤（N-NS组）行16s rRNA测序，对差异代谢物和微生物行Spearman相关性分析。 2.取新西兰白兔雌25只、雄24只，在兔耳腹侧作直径为1.5cm的全层切口，4个/兔耳。术后2周起测量创面瘢痕，用游标卡尺测耳部瘢痕最凸起点全层厚度减去瘢痕周围正常皮肤全层厚度，取每只兔8个创面的均值，得到宏观瘢痕厚度（MST）。术后4周（T1）分组，瘢痕增生明显、MST＞1.9mm实验兔被分配至瘢痕易感组（H组:18只），反之为瘢痕不易感组（L组:20只）。收集粪样行16s rRNA测序和非靶代谢组检测，并使用Ringer液和20％脱脂牛乳液1∶1混合作溶液（对照液），制备成H组、L组菌液。 3.建模后随机选取5只兔纳入BIOFM组，术后1周起连续喂食乳酶生片（0.1g/只/天）2周;选取6只兔纳入GENTS组，术后1周起连续肌注硫酸庆大霉素（4千单位/kg/天）1周。在T1测量MST、收集粪样行16s rRNA测序并处死。 4.从H组、L组随机选取4只兔子至H-CON、L-CON组;剩余的为肠菌交换组，即H-FMT组和L-FMT组。菌群交换前FMT组作伪无菌处理:抗生素连续灌胃3天，1次/天（盐酸万古霉素100mg/kg、氨苄西林200mg/kg、甲硝唑200mg/kg、硫酸新霉素200mg/kg）;CON组灌等量生理盐水。4天洗脱期后开始肠菌交换灌胃。H-FMT组、L-FMT组分别接受提前制备的L组、H组菌液灌胃，7.3ml/次，3次/周，连续灌胃4周。CON组接受等量对照液灌胃。分别在建模后35天（T2）、术后49天（T3）及术后63天（观察终点，T4）采集粪样行16s rRNA测序，T4的粪样行非靶代谢组检测。所有组每周测量MST、拍照并在处死后采集兔耳瘢痕，行HE染色测瘢痕增生指数SEI和Masson染色。菌群、代谢物、MST等表型作Spearman分析。 研究结果: 1.16s rRNA和宏基因组测序结果提示K组物种多样性高于N组，菌落结构有分群差异。LEfSe分析提示青春双歧杆菌（LDA=4.32）、古菌sp.Atlit 24N盐富饶菌（LDA=3.21）、克拉斯噬菌体YS1 2.2437（LDA=2.50）等为K组特征微生物（p＜0.05），副血链球菌(LDA=2.01)等为N组的特征菌种。功能注释及物种来源分析提示K组富集的亚单位SecG等同源基因及α-淀粉酶等酶类均为青春双歧杆菌占主要贡献。K-KD、K-NS、N-NS三组间菌落有显著差异(p＜0.05),青春双歧杆菌在K-NS显著高于K-KD和K-NS(p＜0.001)。K、N组粪样、血样代谢物差异显著(p＜0.01);其中血样牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)及多种粪样胆汁酸为差异代谢物，在N组富集;粪样皮质醇等在K组富集。Spearman分析发现上述差异菌种可直接或间接影响血液中TCDCA,如青春双歧杆菌、古菌与TCDCA负相关(r=-0.50,p=0.002;r=-0.40,p=0.017)。 2.H、L、BIOFM、GENTS组性别、体重均无差别。H组MST(2.25±0.33mm)显著高于L组MST(1.68±0.23mm)(p＜0.001),病理上SEI、胶原含量有类似结果(p＜0.05)。H组肠道菌群物种多样性高于L组，菌落结构差异显著(p＜0.05)。LEfSe分析提示考拉杆菌属(LDA=3.66)为L组的特征菌属，丁酸球菌属(LDA=3.67)、经黏液真杆菌属(LDA=3.31)为H组特征菌属。 3.GENTS 组(2.18±0.16mm)、BIOFM 组(2.13±0.31mm)MST 均高于 L 组(p＜0.05),SEI、胶原含量有类似趋势，提示瘢痕增生明显。BIOFM、GENTS组物种多样性较L组下降，三组间菌落结构差异显著(p＜0.05)。甲烷球形菌属均在BIOFM、GENTS组升高(vs.L 组，p＜0.05)。 4.接受了 L组肠菌移植的H-FMT组MST比其对照组明显下降(1.21±0.30mm vs.2.14±0.23mm,p＜0.01),反之，L-FMT 组比 L-CON 组的 MST 明显升高(2.01±0.31mm vs.0.83±0.15mm，p＜0.001),SEI、胶原含量有类似结果。T1-T4菌群分析提示灌胃能恢复伪无菌处理后多样性的下降，最终菌群与供体菌群有大部分重叠。LEfSe分析提示H-FMT组中L组特征菌种考拉杆菌属(LDA=3.66)明显升高，原H组富集的丁酸球菌属(LDA=3.60)显著下降;原H组轻度富集的菌属在L-FMT组也显著升高。肠菌移植前后均起关键作用的代谢物为TCDCA和硫酸雌酮，其中MST与TCDCA明显负相关(r=-0.61,p=0.004)，后者与丁酸球菌属(r=-0.62，p=0.003)等多种菌群显著相关。 研究结论:肠道微生物紊乱与瘢痕疙瘩有明显相关性，差异肠道微生物直接或间接调节代谢物，影响瘢痕增生，即为肠道-代谢物-瘢痕轴，其中，临床研究和动物模型的共同差异代谢物TCDCA或能为菌群相关辅助治疗的开发提供方向。
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