摘要
感染兔的11种艾美耳属球虫中，中型艾美耳球虫（Eimeria media）是危害较大的优势虫种之一，对养兔业造成严重的经济损失。兔球虫病主要通过药物防治，但随着耐药株的出现和饲料减抗、替抗、禁抗的推进，药物防治逐渐显现其局限性。球虫疫苗可替代药物防控球虫病，是当前的研究热点，相比于活疫苗，基因工程亚单位疫苗安全、稳定、易于生产，且成本低廉，亟待更多研究。为此，本研究从E. media转录组数据中筛选出两个表面抗原基因（SAG4和SAG13）并进行原核表达，通过动物实验评估重组蛋白的免疫原性，为兔球虫的基因工程疫苗研究提供参考。 用E. media孢子化卵囊提取总RNA，使用RNA测序（RNA-seq）技术进行测序，并从转录组数据中筛选出E. media两个表面抗原Emed-SAG4和Emed-SAG13，利用生物信息学软件对两个抗原进行分析，结果表明Emed-SAG4基因全长723 bp，编码240个氨基酸，分子质量为25.19 kDa，预测前23个氨基酸组成信号肽，在217~239个氨基酸之间存在一个跨膜结构域，等电点为5.53；Emed-SAG13基因全长1059 bp，编码353个氨基酸，分子质量为37.38 kDa，预测前27个氨基酸组成信号肽，无跨膜区，等电点为4.72。B细胞抗原表位预测结果显示，Emed-SAG4和Emed-SAG13可能出现B细胞抗原表位的区域分别有6个和13个，预示Emed-SAG4和Emed-SAG13蛋白可能有较好的抗原性。以相对荧光定量PCR分析Emed-SAG4和Emed-SAG13基因在E. media不同发育阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、裂殖子和配子体）的转录水平，发现两个表面抗原基因均在孢子化卵囊阶段显著高表达。 以pET-30a作为表达载体，His作为蛋白标签，通过密码子优化和基因克隆，构建和鉴定了重组表达载体pET-30a-SAG4和pET-30a-SAG13，并进行两种重组蛋白的诱导表达。结果表明，Emed-SAG4和Emed-SAG13重组蛋白大小分别为21.551 kDa和35.485 kDa。经过原核表达的条件优化和可溶性分析，37℃诱导4 h，Emed-SAG4amp;nbsp;和Emed-SAG13蛋白表达水平分别为40 mg/L和30 mg/L，均主要为包涵体蛋白。利用亲和层析技术提纯重组蛋白，并进行蛋白浓度测定，得到 Emed-SAG4 和Emed-SAG13蛋白浓度分别为1.62 mg/mL和0.62 mg/mL。对两个重组蛋白进行免疫印迹分析，结果重组蛋白均能识别感染E. media的阳性兔血清，具有良好的反应原性。用纯化重组蛋白分别免疫兔，制备抗Emed-SAG4和Emed-SAG13的多克隆抗体，并通过间接免疫荧光试验检测两个蛋白在子孢子、裂殖子和配子体内的定位，结果显示， Emed-SAG4蛋白分布在子孢子表面，Emed-SAG13蛋白分布在子孢子和配子体表面。 用弗氏佐剂混合纯化后的蛋白（Emed-SAG4和Emed-SAG13），两次等量（150μg/次）免疫后以E. media强毒株攻虫，设置空白对照组和攻虫对照组。结果显示， Emed-SAG4和Emed-SAG13蛋白免疫后能诱导机体产生Th1和Th2型细胞免疫反应和体液免疫反应，在料肉比、平均增重、相对增重率和卵囊减少率方面，免疫组均优于攻虫对照组，其中Emed-SAG13蛋白的保护效果相对较好，卵囊减少率为71.05%。 综上所述，本研究从E. media转录组数据中筛选出两个表面抗原基因进行原核表达，通过蛋白纯化获得重组蛋白Emed-SAG4和Emed-SAG13，并研究了重组蛋白的免疫保护效果，结果显示两种重组蛋白有一定的免疫保护力，且Emed-SAG13优于Emed-SAG4，研究结果为兔球虫的防控和基因工程疫苗的研发提供参考。
NETL