摘要
高致病性禽流感是一种传染性强、死亡率高的传染病，H7亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是导致高致病性禽流感的主要亚型之一。2013年以来，H7N9亚型AIV对我国家禽业和公共卫生构成了巨大威胁，因此，加强H7亚型AIV的监测和控制具有重要意义。本研究从纳米抗体的优势出发，利用其体积小、稳定性高及亲和力强等独特性质，拟优化纳米抗体在两种表达系统中的表达条件，同时建立一种基于纳米抗体的H7亚型ELISA检测方法，为H7亚型禽流感的诊断提供一种纳米抗体应用方法。 为比较纳米抗体在大肠杆菌表达系统与毕赤酵母表达系统中的差异，本研究在课题组已筛选出的抗H7亚型禽流感的纳米抗体中选取4个高血凝效价的纳米抗体NB-04、NB-05、NB-11、NB-13，分别构建原核表达载体pET-NB-04、pET-NB-05、pET-NB-11与pET-NB-13及真核表达载体pPICZ-NB-04、pPICZ-NB-05、pPICZ-NB-11与pPICZ-NB-13。在大肠杆菌表达系统中探索了不同温度与不同浓度IPTG对纳米抗体诱导效果的影响。所选抗体在 16℃表达的可溶蛋白浓度均高于 37℃，其中pET-NB-05的表达浓度最高，达到2.711 mg/mL；0.1 mM IPTG表达的可溶抗体浓度均高于1 mM IPTG表达的浓度，其中pET-NB-05浓度最高，可达2.848 mg/mL。结果表明16℃且IPTG终浓度为0.1 mM的条件下纳米抗体表达效果更优。在毕赤酵母表达系统中，本研究探索了不同诱导时间对纳米抗体诱导效果的影响。分别在24 h、48 h、72 h、96 h及120 h测定纳米抗体蛋白浓度，120 h时pPICZ-NB-05浓度最高为0.786 mg/mL，结果表明诱导时间愈久，纳米抗体表达浓度愈高。 为验证纳米抗体功能，本研究将两种系统表达的纳米抗体进行HI试验，所选抗体均表现出良好的抗原结合能力，其中pPICZ-NB-04对待检H7抗原血凝抑制效价最高，达到8log2。选取pPICZ-NB-04表达蛋白作为一抗，鼠源抗His单抗作为二抗，羊抗鼠-HRP作为三抗，建立H7亚型AIV间接ELISA检测方法。经优化后的最终确定反应条件为：一抗1：50倍数稀释，反应1 h；二抗1：2000倍数稀释，反应1.5 h；三抗1：1000倍数稀释，反应2 h；TMB显色液显色60 min。该检测方法对H5亚型及H9亚型AIV均无明显交叉反应，对H7亚型AIV抗原具有良好的特异性。当H7抗原原液稀释800倍后仍能检测出明显的ELISA反应，证明该方法具有较高的灵敏性。 综上所述，本研究针对所选纳米抗体分别构建原核与真核表达载体，并优化其表达条件，其中酵母表达系统效果较优。同时，通过多个条件的优化初步建立间接ELISAamp;nbsp;检测方法，为纳米抗体在H7亚型禽流感的诊断应用奠定了技术基础。
NETL