摘要
茄科植物是全球广泛种植的重要作物类型，对世界经济具有重要贡献。马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)在全球范围内的广泛传播给茄科植物产业带来了严重的质量和产量挑战。目前仅在马铃薯和辣椒中实现了对PVY抗病基因的克隆，但这些研究为抗病育种提供了宝贵资源。来自辣椒农家种(landrace)CM334中的Pvr4基因，编码一个CC(coiled-coil)型NLR(nucleotide-binding leucine-rich repeat containing)蛋白(CNL)，赋予了植物对PVY的抗性。目前尚无PVY株系能突破Pvr4介导的抗性，这使得Pvr4成为培育持久抗PVY品种的关键基因，关于Pvr4的抗病机制仍不清晰。本文利用分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物化学等手段，克隆了Pvr4等位基因Pvr4-S，对其进行了亚细胞定位和抗病机制等的初步研究。 在对我们搜集到的三个不同来源的CM334辣椒的Pvr4基因进行克隆时，我们发现了该基因存在自然变异性。与已报道的Pvr4相比，这些基因序列存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)以及片段插入与缺失(insertion-deletion，InDel)。其中，西北农林科技大学来源的CM334中的Pvr4等位基因与已报道的Pvr4相比，仅存在2个核苷酸水平的SNP差异，导致一个氨基酸突变，我们将其命名为Pvr4-XB。江苏省农业科学院来源的CM334中的Pvr4等位基因与已报道的Pvr4相比，存在17个核苷酸水平的SNP，导致15个氨基酸突变，我们将其命名为Pvr4-JS。广东省农业科学院来源的CM334的序列较短的Pvr4等位基因，与已报道的Pvr4相比存在77个核苷酸SNP和2个大片段缺失，因其长度较短，我们将其命名为Pvr4-S。此外，发现Pvr4-XB、Pvr4-JS和Pvr4-S均存在两个转录本，除Pvr4-S的较短转录本外，其余转录本均能在本氏烟上识别PVY并诱导超敏反应(hypersensitive response,HR)和细胞死亡。 为明确Pvr4-S的亚细胞定位，我们利用激光共聚焦显微镜技术，在表达细胞质膜(plasma membrane，PM)标记物EGFP-AtSYP121的转基因本氏烟叶片中同表达带有tagRFP标签的Pvr4-S、植物细胞壁中胶层(middle lamella)标记物AtPRX64、胞内定位的CNL蛋白ZAR1,对比其亚细胞定位，证明了 Pvr4-S定位在植物细胞壁的中胶层。此外，我们通过原生质体释放和果胶酶消化实验，进一步验证了其在细胞壁的定位。通过构建一系列的Pvr4-S的截短突变体，我们将影响Pvr4-S细胞壁定位的区段缩小到393-805aa 了区域。进一步的研究发现Pvr4-S(△1-35aa)-EGFP与tagRFP-NIb在细胞外存在共定位，而Pvr4-S与添加了核定位信号的NIb-NLS共表达无法导致坏死，提示Pvr4-S对NIb的识别可能发生在胞外。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和萤火虫荧光素酶互补实验(luciferase complementation imaging,LCI)没有发现Pvr4-S与PVY NIb直接互作的证据，表明两者可能在胞外通过间接作用引发抗病。 为探究Pvr4-S的S-棕榈酰化位点是否与其他细胞壁定位的NLR蛋白一样与抗病相关，我们对Pvr4-S的三个S-棕榈酰化位点进行了点突变，在本氏烟上分别共表达这三个位点突变的Pvr4-S和PVY,发现其中一个可能的S-棕榈酰化位点C281对Pvr4-S介导的PVY抗性至关重要。利用棕榈酰化抑制剂2-Bromohexadecanoic acid(2-BP)，我们进一步证明了 S-棕榈酰化在Pvr4-S诱导的免疫反应中起到了关键作用。此外，为探究Pvr4-S与其他CNL蛋白的相似性，我们将Pvr4-S的CC结构域的三维结构叠加在ZAR1的CC结构域形成的五聚体结构上，发现可以形成类似的孔道状结构，且孔道表面带正电荷，靠近孔道内测有带负电荷氨基酸。在Pvr4-S自激活突变体的基础上，突变α1螺旋上的E2和E13两个带负电荷的酸性氨基酸残基，发现二者均参与了 Pvr4-S的免疫激活功能。 综上所述，本研究发现了 CNL抗病蛋白Pvr4-S在细胞壁中胶层的定位，阐明了其可能通过在胞外间接识别PVY NIb发挥抗性，揭示了 Pvr4-S的可能的S-棕榈酰化位点、CC结构域中的α1螺旋上带负电荷的氨基酸残基在Pvr4-S介导的免疫反应中具有重要作用。这些发现为深入理解Pvr4-S诱导免疫的机制、利用和改造Pvr4-S培育持久抗PVY品种提供了理论基础。
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