摘要
黄曲霉毒素（Aflatoxins，AF）是由黄曲霉?寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，主要分布在花生?玉米?大米等农产品中，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最强、危害最大。大肠杆菌CueO是一种多铜氧化酶（MCOs），以分子氧为最终受体，能氧化多种结构复杂的底物，如酚类化合物、木质素等。本实验室前期研究发现大肠杆菌漆酶CueO可以将AFB1氧化为几乎无毒的产物AFQ1。为了获得高效代谢AFB1的酶分子，本研究采用定向进化技术，对漆酶CueO进行分子改造，为将来在农业、食品等领域的应用奠定实验基础。 本研究利用易错PCR构建漆酶CueO基因突变体文库，以2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为底物进行高通量初筛，以AFB1为底物进行复筛。经过多轮筛选后，获得两个代谢AFB1活性较高的突变体D132E和P265R。以ABTS为底物，对突变体D132E和P265R进行酶动力学分析。结果显示，突变体D132E和P265R的Km值分别为5.46μM和4.99μM，较野生型CueO的Km值13.73μM低，表明突变体与底物的结合更紧密。通过Km/Kcat比值可知，D132E和P265R较野生型漆酶的催化效率分别提高了2.47倍和2.70倍。以AFB1为底物，对突变体D132E和P265R进行代谢AFB1的酶动力分析，结果表明，突变体D132E和P265R的Km值分别为253.0μM和266.4μM，两者均较野生型Km值329.2μM低，说明突变体酶与AFB1结合较好。突变体在8小时内能将10μg/mL的AFB1完全代谢，与野生型漆酶CueO相比，分别提高了1.64倍和1.61倍，因此突变体对AFB1的代谢活性有明显提升。此外，介体也能增加漆酶对于底物的代谢能力。未加入介体时，突变体酶代谢AFB1的比活力为0.19U/mg，加入介体ABTS后，突变体酶代谢AFB1的比活力为0.67U/mg，说明加入介体后，酶对AFB1的代谢作用增强。 为了进一步研究漆酶CueO代谢AFB1的机制，以大肠杆菌漆酶CueO晶体结构（PDB ID：1kv7）为模板，通过SWISS-MODEL同源建模创建了突变体D132E、P265R的结构模型。利用AutoDock Vina将野生型和突变体与AFB1进行分子对接。预测结果显示，Pro-35、Asp-38、Leu-72、Leu-73、Leu-74、Asn-217等氨基酸残基可能与配体分子存在相互作用，上述氨基酸都远离132位点和265位点，表明突变体D132E、P265R不影响底物口袋的构象。此外，用PyMOL软件分析132位点与周围氨基酸的相互作用力，结果发现，野生型CueO的Asp-132与Arg-82形成氢键作用力，当132位点的Asp突变为Glu后，除了上述作用力外Glu-132还与His-468形成氢键作用力。由于132位点位于ΙΙ型铜的通道口，突变体D132E通过疏水作用和氢键作用力阻止ΙΙ型铜流失，提高CueO氧化能力。野生型CueO的Pro-265与Leu-334、Ser-335形成氢键作用力，当265位点的Pro突变为Arg后，除了上述作用力外Arg-265还与Glu-266形成氢键作用力。 综上所述，本研究通过对大肠杆菌漆酶CueO的分子定向进化，筛选到了两个突变体D132E和P265R，不仅增强了漆酶的氧化能力，也提高了对AFB1的代谢能力。并根据对接结果，进一步揭示了大肠杆菌漆酶CueO代谢AFB1的机制。
NETL