摘要
龙胆二糖是由两分子葡萄糖通过β-1，6糖苷键连接而成的。因其具有独特的结构和益生元特性，在功能性食品的应用上备受关注。它可以改善食品风味、抑制有害微生物繁殖，也可以改善结肠、促进肠道益生菌生长。制备低聚糖的企业工业副产物里具有很高浓度的葡萄糖，直接排放会对环境造成一定的损害。我国目前制备龙胆二糖的工业能耗高、产量低，且菌株来源的安全性饱受争议。针对安全、高效制备龙胆二糖以及提高企业工业副产物的利用率，本文对来源于食源性微生物菌种库中的黑曲霉（Aspergillus niger）进行β-葡萄糖苷酶（Bgl）酶活筛选及发酵优化，并将黑曲霉的β-葡萄糖苷酶（AnBgl）在毕赤酵母中克隆表达，同时对其进行分子改造探究，最后利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性对龙胆二糖的制备条件进行优化，主要研究结果如下： （1）建立了黑曲霉野生菌株高产β-葡萄糖苷酶的发酵体系。对7株来源于食源性微生物菌种库的黑曲霉进行β-葡萄糖苷酶酶活筛选,确定HQ-27为高产菌株后对其进行单因素及响应面优化，确定最佳发酵配方为乳糖7.90 g/L，酵母膏4 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.8 g/L，一水合硫酸锰0.19 g/L，吐温80 0.2%，在装液量为107 mL，pH为5.2，温度为30℃的条件下200 rpm发酵8 d，在此条件下可获得β-葡萄糖苷酶酶活为3.23 U/mL。 （2）表征AnBgl的酶学性质。构建异源表达载体并采用同源重组的方法将AnBgl整合到毕赤酵母基因组中，得到工程菌株P. pastoris GS115/pPIC9K-AnBgl。发现AnBgl序列长度为2544 bp，蛋白条带大小为140 kDa。经过甲醇诱导蛋白外分泌后通过酶活测定对比两种表现型的产酶量，确定毕赤酵母菌株外分泌AnBgl的最佳表现型为Muts型，酶活高达221 U/mL，是Mut+型酶活的4倍。对外分泌蛋白进行亲和层析柱纯化后对酶学性质进行测定，结果显示AnBgl最适温度与pH分别为60℃与4.5，具有良好的温度稳定性与pH稳定性，通过动力学测定表明AnBgl对pNPG与龙胆二糖均具有良好的水解能力。 （3）初步探索AnBgl催化口袋的关键位点。对AnBgl进行分子对接，找到催化口袋，通过分析催化反应机制，对催化口袋内的关键位点进行丙氨酸扫描，构建了5株丙氨酸突变株。通过酶活测定发现S434A无明显酶活，L124A酶活与Y231A酶活有明显升高，经过动力学测定后发现L124A和R139A两株突变株与龙胆二糖的亲和度与原始菌株相比有明显的差异性，L124A菌株与R139A菌株从原始的Km为11.08amp;nbsp;mM分别升至Km为30.63 mM和Km为14.68 mM，此结果表明这三个氨基酸位点对龙胆二糖的合成起着关键作用，其中L124A与R139A突变株有利于催化口袋中龙胆二糖的积累。 （4）建立了高效低能耗的龙胆二糖制备工艺。通过镍柱亲和层析对 P. pastoris GS115/pPIC9K-AnBgl 表达的 Bgl 进行纯化。利用 β-葡萄糖苷酶的逆水解活性制备龙胆二糖，通过单因素及正交优化，获得最优的龙胆二糖制备工艺：在底物浓度为G g/L， pH为P，温度为M℃，酶的添加量为V U/g葡萄糖时，X rpm反应Y h，可获得163.4 g/L龙胆二糖，其转化率为19.22%，虽与目前产量最高的19.36%差0.14%，但酶的添加量仅为最高产量的Z，节省的酶量有利于降低工业耗能成本，且此Bgl来源安全，非常具有工业应用前景。 （5）对工业副产物的循环利用。根据优化好的龙胆二糖制备工艺体系，对工业副产物进行加工利用，通过HPLC检测可转化制备出89.10 g/L的龙胆二糖，这有利于提高企业的经济效益，减少环境污染。
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