摘要
目的: 非综合征型先天缺牙是常见的牙齿发育性疾病，对患者功能、容貌、发音等都产生一定影响。从基因水平的发病机制研究可以为未来的精准医疗提供遗传学理论基础。通过在临床诊疗中收集非综合征型先天缺牙中国家系的病例资料，应用全外显子测序技术寻找该家系成员中新的突变基因或者已知致病基因新的突变位点，并且对其进行初步功能分析。 方法: 1.收集非综合征型先天缺牙中国家系病例，对先证者及其家属进行临床检查（包括口腔检查、全身检查、影像学检查）以及资料采集，绘制家系图谱。 2.采集先证者及其家属的外周静脉血5ml，提取DNA,通过全外显子组测序技术进行基因检测同时筛查分析，对筛选出来的突变位点进行氨基酸的保守性分析，进一步Sanger测序验证发现的可疑致病基因。 3.查询候选基因与牙齿发育的关系;运用生物信息学软件预测突变蛋白质的等电点、分子质量、二级结构和三维构象的变化。 4.构建筛选出的目的基因SPRY4野生型（WT）与突变型（MUT）质粒，选择pIRES2-EGFP作为载体，将其分别转染至HEK-293细胞，收样，Western Blot及qPCR检测SPRY4的表达水平。 5.通过Western Blot技术检测下游通路蛋白p-MAPK的表达情况，观察突变位点对ERK/MAPK信号通路的影响。 结果: 1.纳入该家系的5个成员，先证者（男性，14岁）、先证者父亲及爷爷患病，先证者母亲及奶奶均正常。家系成员均属于少数牙缺失，先证者牙齿缺失5颗，缺牙位置主要位于前牙以及前磨牙，同时伴有22牙锥形牙。除缺牙表现外，无其他组织的先天发育缺陷。 2.全外显子测序结果显示，共筛选到65536个突变位点，经过初步筛选分析，得到三个候选基因及错义突变位点，分别为GJB4:exon2:c.C292T:p.R98C、IFIH1:exon5:c.A1093G:p.K365E 以及 SPRY4:exon2:c.C632T:p.T211M。GJB4:p.R98C 突变氨基酸在不同物种之间高度保守;IFIH1:p.K365E以及SPRY4:p.T211M在某些物种中具有保守性。Sanger测序进一步验证三个突变位点，在该家系中符合疾病共分离。 3.SPRY4在小鼠磨牙牙齿发育过程中的蕾状期、帽状期有表达。预测结果显示SPRY4突变蛋白等电点未变，分子质量变大;突变蛋白质的α螺旋明显增长，延伸主链、β-转角和无规卷曲分别微量减少。通过三维建构发现突变可引起蛋白质空间构象变化。 4.Western Blot 结果显示，与 WT-SPRY4 组相比，MUT-SPRY4 组的 SPRY4 蛋白表达水平未见明显变化。经qPCR验证，MUT-SPRY4组的SPRY4 mRNA表达水平显著高于WT-SPRY4组。 5.在HEK-293细胞中，MUT-SPRY4组的p-MAPK表达水平与WT-SPRY4组相比无统计学差异。 结论: 1.通过全外显子测序技术在一个非综合征型先天缺牙中国家系中鉴别出三个位于不同基因的错义突变(GJB4:exon2:c.C292T:p.R98C、IFIH1:exon5:c.A1093G:p.K365E以及SPRY4:exon2:c.C632T:p.T211M),扩充了非综合征型先天缺牙的基因谱。 2.SPRY4基因与牙齿的生长发育相关，SPRY4:c.C632T这一基因突变可能引起相应产物改变，从而参与该家系单纯性先天缺牙的致病原因。
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