摘要
草甘膦（Glyphosate）是一种高效、低毒、广谱除草剂，已成为世界第一大除草剂。由于草甘膦的广泛使用，其残留对人类和环境的影响已经引起了广泛的关注。草甘膦水溶性高，极易通过土壤进入地表水和地下水。在土壤和水中残留的草甘膦，初期会被本土微生物降解，然后以一定浓度在土壤和水中长时间残留。研究表明，草甘膦残留对微生物群落、生态环境和人类健康造成危害。因此，分离筛选草甘膦高效降解菌，研究降解菌在环境中的降解能力及其对本土微生物的影响，阐明草甘膦的微生物代谢途径，进而揭示微生物降解草甘膦的分子机制，具有重要的理论意义和潜在应用价值。 本课题组前期分离筛选到一株能够以草甘膦为唯一碳源生长的高效降解菌株中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）26B。本论文在此基础上深入研究菌株26B的降解代谢途径和分子机制，取得主要结果如下： （1）菌株26B对泥水污染体系中草甘膦的降解有显著的促进作用，18 h可完全降解添加的草甘膦（200 mg/L）。微生物群落多样性分析结果表明苍白杆菌的丰度随着草甘膦的降解而逐渐升高，在草甘膦完全降解后逐渐下降。此外，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、黄藻属（Flavisolibacter）、沙壤土杆菌属（Ramlibacter）丰度显著上升，也可能参与了土壤中草甘膦的降解。 （2）通过UPLC-QE/MS检测菌株26B对草甘膦的降解产物。主要降解中间产物为氨甲基膦酸（Aminomethylphosphonic acid，AMPA）。同时，在降解的第36 h检测到肌氨酸和甘氨酸。结果表明，菌株26B可能同时存在AMPA降解途径和肌氨酸降解途径。 （3）通过全基因组测序分析，发现菌株26B存在与GOX（草甘膦氧化还原酶）相似性为36.04%蛋白，并命名为OiGOX。同时，菌株26B存在完整的C-P裂解酶基因簇。通过敲除基因OiGOX发现，草甘膦的降解速度显著降低，野生型在24 h内可完全降解添加的草甘膦（200 mg/L），而突变株降解率仅为 47%。而敲除另外一个与GOX 相似蛋白编码基因 1381 和 C-P 裂解酶关键基因 phn 对草甘膦降解没有显著影响。 （4）构建重组表达载体pGEX-6p-1-OiGOX，并在Escherichia coli BL21中融合表达和纯化。OiGOX 等电点为 7.64，分子量为 72.29 kDa。通过酶活的检测发现， OiGOX具有草甘膦氧化还原酶活性。对OiGOX进行了酶学性质的研究，得到其最适反应温度为30℃，最适反应pH为8.0。金属离子反应显示，1 mM Mg2+、Na+、Ca2+能提高OiGOX的活性，Fe3+能够100%抑制OiGOX的活性。 本论文研究表明菌株26B在泥水污染体系可以发挥高效降解作用。通过对草甘膦降解产物的鉴定分析，并结合基因敲除从基因水平上阐明菌株26B对草甘膦的降解机制，丰富了微生物降解草甘膦的理论基础。通过异源表达获得具有草甘膦氧化还原酶活性蛋白OiGOX，为草甘膦污染环境的生物修复提供高效降解菌株和基因资源。
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