摘要
水稻种子休眠是一个重要的农艺性状。太强的休眠性会导致发芽延迟、出苗和生长不整齐，休眠性缺乏则会引起穗发芽，影响种子质量和粮食品质。前期，本实验室图位克隆了编码F-box蛋白的水稻种子休眠新基因OsSDRF1，初步揭示了OsSDRF1可能参与生长素代谢途径。在此基础上，通过酵母双杂交（Y2H）筛库、Y2H一对一互作以及双分子荧光互补（BiFC）筛选和鉴定了OsSDRF1互作的潜在底物蛋白，利用蛋白质组学研究了 OsSDRF1 的调控网络，分析了部分互作蛋白在调节水稻种子休眠中的功能。主要结果如下： 1、综合应用Y2H筛选日本晴和HJX74种子核文库，Y2H一对一互作以及BiFC等方法，鉴定到多个 OsSDRF1 的互作蛋白，包括：ABA 信号途径中的蛋白磷酸酶OsPP2C51，IAA信号和代谢途径中的OsGH3.8和OsIAA16，GA信号途径中的GRAS蛋白 OsSLRL2、α 淀粉酶 OsAmy3E 和 OsAmy2，乙烯响应的转录因子 OsEBP89 和OsERF68，ROS途径的过氧化氢酶OsCATB，蛋白激酶OsCK2β1和OsNDPK4，以及其他途径的乙醇脱氢酶OsALDH2a、活化激酶C受体OsRACK1B和锌指结构蛋白ZF-CCHC7。值得注意的是，OsCATB在筛选日本晴和HJX74的酵母文库时都能鉴定到。 2、利用蛋白组学对OsSDRF1突变体GE54与W22s的成熟种子进行了蛋白测序，总共鉴定了144个差异蛋白，包括84个上调蛋白和60个下调蛋白。GO注释表明差异蛋白的分子功能主要参与催化和结合，KEGG分析表明差异蛋白主要参与了氨基酸代谢、糖代谢、脂质代谢、基因转录、蛋白翻译等途径。根据功能注释，我们选择了11个可能调控种子休眠的差异蛋白，利用Y2H分析其是否与OsSDRF1互作，从中筛选OsSDRF1的靶蛋白。结果表明，胚胎发育相关蛋白ERD15、分子伴侣蛋白OsDjA4、胚乳特异蛋白OsEnS-86、磷酸激酶OsPP2Ac-5等与OsSDRF1存在稳定的互作，辅酶A连接酶OsAAE3、几丁质酶Cht4、硫腺苷甲硫氨酸合成酶OsSAMS3等与OsSDRF1的互作不稳定。 3、根据OsSDRF1的互作蛋白筛选结果，以ZH11为背景，创建了11个互作蛋白的基因功能缺失突变体。2021-2022 年期间，分别在海南和广州三个独立的环境下对上述突变体的休眠表型进行了鉴定。6个突变体的发芽率均显著低于对照ZH11，包括生长素代谢基因OsGH3.8的突变体cr290、生长素外排载体OsPIN2的突变体cr970、水通道蛋白OsPIP1;3的突变体cr720、α-淀粉酶OsAmy2的突变体cr040、核苷二磷酸激酶OsNDPK4的突变体cr410、锌指结构蛋白ZF-CCHC7的突变体cr480。但是破 除种子休眠后，上述突变体与ZH11之间的发芽率无明显差异，说明上述基因并不影响种子活力，仅参与种子休眠的调控，是 OsSDRF1 的潜在靶蛋白。此外，我们也构建了OsSDRF1和一些互作蛋白的双突变体材料，后续将开展种子休眠表型的鉴定。 综上所述，本研究通过多种手段筛选并鉴定出 OsSDRF1 的多个潜在底物蛋白，并通过构建突变体从遗传水平上分析了互作蛋白是否参与种子休眠调控，研究结果有助于进一步解析 OsSDRF1 调控种子休眠的分子机制，对解决水稻等作物的穗发芽问题具有一定的指导意义。
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