摘要
鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌引起的一种急性败血性传染病。该病主要感染 2～7 周龄的雏鸭，患病鸭以共济失调等神经症状为特征。鸭疫里氏杆菌的血清型众多，不同血清型之间无明显交叉保护性，这使得无法通过疫苗免疫来有效预防鸭疫里氏杆菌的感染。目前，鸭疫里氏杆菌病的治疗主要以抗生素为主。早期诊断鸭疫里氏杆菌，并进行精准的药物治疗对防控鸭疫里氏杆菌病具有重要意义。然而，当前鸭疫里氏杆菌的检测主要以聚合酶链式反应（PCR）和荧光定量 PCR（qPCR）为主要代表的分子生物学检测方法。这些方法都存在操作复杂、需要昂贵的仪器、无法现场即时检测的问题。本研究对广东省肇庆市不同鸭场疑似感染鸭疫里氏杆菌的病鸭进行细菌的分离鉴定，对分离菌株进行药物的敏感性测定，给临床用药提供参考。并且，以分离菌株为检测对象，建立了基于CRISPR-Cas系统检测鸭疫里氏杆菌及其耐药基因的新方法。检测方法的可行性分析包括体系的优化、特异性和灵敏性的评估、PCR 和 qPCR 检测方法的对比。最后利用本研究建立的检测方法进行临床样品的检测，评估现场即时检测的可行性。 结果表明，从广东省肇庆市不同地区养鸭场采集病鸭脑组织 47 份，有 13 份鸭疫里氏杆菌分离阳性，分离率为27.7%。药敏结果显示，分离菌株对氨基糖苷类药物的耐药率普遍较高，占比 53.8%～92.3%。β-内酰胺类药物的耐药率较低，占比0.0%～15.4%。一管式检测体系优化结果表明，不同引物组合的检测结果存在差异，最优引物组合可以使检测结果的荧光强度更高。检测体系（50 μL）各组分浓度为：探针浓度：16 μmol/L，crRNA 浓度：100 nmol/L，Cas12a 蛋白：100 nmol/L。检测的特异性和灵敏性结果表明，本研究建立的检测方法可以准确检测鸭疫里氏杆菌及其耐药基因，检测准确性100.0%，鸭疫里氏杆菌检测灵敏性为2.06 copies/μL，耐药基因floR检测灵敏性为1.37 copies/μL，耐药基因tetX检测灵敏性为1.96 copies/μL。对 70 个鸭疫里氏杆菌鸭脑组织直接检测结果显示，有 20 个鸭脑组织检测结果为阳性，阳性率为28.8%。20个鸭疫里氏杆菌阳性鸭脑组织中，有16个携带floR耐药基因，携带率为 80.0%，有 17个携带 tetX耐药基因，携带率为 85.0%，直接检测结果与PCR和qPCR检测结果一致。 本研究通过对广东省肇庆市不同鸭场鸭疫里氏杆菌的分离鉴定，药物敏感性测定，发现鸭疫里氏杆菌分离株对临床常用抗生素耐药严重。RPA-CRISPR一管式检测体系可以快速、简便、准确检测鸭疫里氏杆菌，对鸭疫里氏杆菌的早期诊断及治疗提供技术参考。
NETL