摘要
研究目的: 肺癌是所有人类癌症中最常见的死亡原因，大多数与肺癌相关的死亡是由转移引起的。肺癌最易发生转移的部位是大脑，在疾病过程中，高达50％的癌症最终发展为脑转移(Brain metastasis,BM)。虽然在肺癌的治疗方法取得许多进展，但对于肺癌脑转移的治疗方法非常有限且预后较差，肺癌脑转移瘤患者的中位生存期仅为6个月。作为脑内分布最广泛的一类胶质细胞，星形胶质细胞( Astrocyte AS)构成了原发脑肿瘤的肿瘤微环境。而在肺癌脑转移的些研究表明，肿瘤细胞侵袭脑实质与星形胶质细胞的局部活化有关，活化的星形胶质细胞在肿瘤细胞侵袭脑实质过程中聚集在肿瘤细胞的转移灶周围。但星形胶质细胞是否对肺癌脑转移后的发展发挥作用仍待深入研究。 本实验室之前的研究表明，在原发性脑肿瘤髓母细胞瘤中，肿瘤微环境中的星形胶质细胞具有促进肿瘤发展的作用;进一步的机制研究显示，星形胶质细胞可以通过分泌TNF-α促进髓母细胞瘤的发展。那么，星形胶质细胞是否也会构成脑转移瘤的肿瘤微环境并且发挥影响肿瘤发展的作用呢？本论文利用肺癌脑转移实验模型针对这一科学问题开展研究，并阐述其分子机制。 研究方法: 1.构建脑转移肿瘤模型:用颅内注射的方法将小鼠肺腺癌细胞( LLC细胞)注射到小鼠侧脑室建立肺癌脑转移肿瘤模型。 2.利用病理切片免疫组化和冰冻组织切片免疫荧光方法，检测临床病人样品及小鼠模型肺癌脑转移肿瘤微环境中的星形胶质细胞。 3.利用体外共培养体系检测星形胶质细胞对于LLC细胞增殖和凋亡的影响,分别采用CCK-8方法和EdU掺入实验检测肿瘤细胞增殖，采用Cleaved caspase3(CC3)免疫荧光染色和流式细胞分析方法检测肺癌细胞凋亡。 4. 利用上述方法检测星形胶质细胞对于LLC细胞凋亡的影响是否通过其分泌的分子发挥作用，即利用星形胶质细胞条件性培养基(Astrocyte conditioned medium,AS-CM）对LLC细胞进行处理。另外，利用脑组织冰冻切片免疫荧光染色方法，探究肺癌脑转移瘤中星形胶质细胞的分布与肿瘤细胞发生凋亡的情况。 5.利用重组TNF-α以及TNF-α中和性抗体在体外对LLC细胞进行处理,检验星形胶质细胞是否通过产生TNF-α对肿瘤细胞凋亡发挥调控作用。 6.利用shRNA方法敲低LLC细胞的TNF-α受体2 （TNFR2）,检测TNF-α调控LLC细胞凋亡是否由TNFR2下游信号通路介导。 7.探究TNF-α是否通过NF-κB信号通路影响LLC细胞的凋亡:Western blot检测星形胶质细胞条件性培养基在TNF-α中和性抗体存在与否的情况下处理LLC后，细胞内NF-κB信号通路的活化;流式细胞分析方法检测星形胶质细胞条件性培养基在NF-κB抑制剂JSH-23存在与否的情况下处理LLC后，肺癌细胞的凋亡。 研究结果: 1.临床病人肺癌脑转移及小鼠肺癌脑转移模型的病理切片免疫组化和冰冻组织切片免疫荧光结果表明脑转移肿瘤微环境中存在星形胶质细胞。 2.在体外共培养体系中，星形胶质细胞和星形胶质细胞条件性培养基（ AS-CM）可以促进LLC细胞的存活，但未促进LLC细胞的增殖;星形胶质细胞条件性培养基（ AS-CM）并未促进LLC细胞周期相关基因的表达。 3. 星形胶质细胞条件性培养基（ AS-CM） 处理的LLC细胞中，细胞凋亡标记物CC3免疫荧光染色以及Annexin Ⅴ/PI流式细胞染色显著减少;肺癌脑转移肿瘤微环境中星形胶质细胞的分布与肿瘤细胞的凋亡呈负相关，即星形胶质细胞分布密集的地方肿瘤的凋亡较少，在星形胶质细胞分布稀疏的地方肿瘤细胞凋亡比较多。 4.星形胶质细胞分泌TNF-α抑制LLC细胞凋亡:外源重组TNF-α处理的LLC细胞凋亡细胞减少;星形胶质细胞条件性培养基（AS-CM）抑制肿瘤凋亡的作用被TNF-α中和性抗体减弱。 5. TNF-α调控LLC细胞凋亡由TNFR2下游信号通路介导:敲低LLC细胞的TNFR2,星形胶质细胞条件性培养基（ AS-CM）抑制肿瘤凋亡的作用被减弱;敲低TNFR2增加LLC细胞在颅内的凋亡，延长LLC颅内转移肿瘤小鼠的生存期。 6.星形胶质细胞产生的TNF-α通过NF-κB信号通路影响LLC细胞的凋亡:星形胶质细胞条件性培养基（ AS-CM）处理的LLC细胞NF-κB信号通路发生活化，并能够被TNF-α中和抗体阻断;另外，NF-κB信号通路抑制剂可以阻断AS-CM抑制LLC细胞凋亡的作用。 研究结论: 1.肺癌脑转移瘤的肿瘤微环境存在星形胶质细胞，且星形胶质细胞抑制LLC细胞凋亡; 2.星形胶质细胞产生的TNF-α调控LLC细胞凋亡是通过TNFR2下游NF-κB 信号通路介导。
NETL