摘要
麦角硫因是一种稀有天然的氨基酸，具有抗氧化损伤、维持氧化还原平衡保持人体健康等功效。然而人体自身不能合成麦角硫因，只能从食物中获取。金针菇（Flammulina filiformis）营养丰富，美味可口，是人体获取麦角硫因的来源之一。但是金针菇麦角硫因含量偏低，其表达调控机制尚不明确。研究表明金针菇麦角硫因的生物合成由Ffegt1、Ffegt2和Ffegt3三个基因共同合成。进一步生物信息学分析表明这三个基因分别在金针菇基因组的不同染色体上，而且其启动子序列的同源性不高，说明金针菇麦角硫因的合成途径有其独特的调控机制。因此，本文采用金针菇内源抗性pyrG基因为目标基因建立金针菇的体外CRISPR-Cas9基因组编辑系统，进而以Ffegt1基因的启动子序列pFf-egt1为目的序列进行敲除，尝试揭示金针菇EGT合成基因Ffegt1的启动子调控元件功能，为解析金针菇EGT的合成调控机制奠定基础。同时构建了农杆菌穿梭载体尝试在金针菇体内建立CRISPR-Cas9基因组编辑系统，并比较两种遗传转化方式的效率。主要研究结果如下： （1）确定了金针菇对5-FOA和Basta除草剂的最低抑制浓度及BlpR基因的遗传稳定性。结果表明金针菇对5-FOA和Basta的最低抑制浓度均为250μg/mL。构建了由香菇gpd启动子和终止子PCT辅助构成的草铵膦抗性基因BlpR表达框的pCAMBIA3301-Legpd-BlpR-PCT双元载体，与骨架载体pCAMBIA3301上由CaMV35S启动子和CaMV poly（A）构成的草铵膦抗性表达框进行对比，利用ATMT法将两种抗性表达框转进金针菇中，发现由香菇gpd启动子启动的草铵膦抗性表达框能够在金针菇中稳定遗传。 （2）鉴定了FfCas9蛋白的切割能力。采用原核大肠杆菌表达系统，异源表达了金针菇密码子优化后的Cas9蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示蛋白成功表达。取粗酶液与特异性sgRNA4体外组装后对目的序列pFf-egt1进行了体外切割实验并产生了特异性片段，确定了FfCas9蛋白的切割活性。 （3）建立了金针菇体外CRISPR-Cas9基因编辑系统。以pyrG为目标突变基因，设计并在体外高效制备了sgRNA-Cas9复合体RNP1和RNP2，然后在体外切割目的基因pyrG以鉴定其活性。然后采用PEG法将RNP1、RNP2转化进YX-D-D单核金针菇菌株的原生质体。研究结果表明通过在体外试验中不能切割目的基因的RNP复合物转进金针菇原生质体后被证明也不能切割目的基因。在转化金针菇原生质体时Triton X-100的加入有助于外源物质进入原生质体。对获得的5株金针菇突变株进行Sanger测序，3株显示在靶点发生了小片段的插入，说明这些突变体中主要是通过非同源末端连接（NHEJ）途径导致基因组信息的改变，该体系敲除率为60%。 （4）用（3）建立起的金针菇体外敲除系统对pFf-egt1启动子序列进行敲除。取两靶点前后1000bp作为同源臂与（1）中鉴定的抗性筛选标记组合成同源模板与对应的RNPs复合物共同转进金针菇原生质体中。对拟转化子进行盲筛，未获得目的序列碱基缺失或增加的突变株；对在抗性平板筛选到的6株拟转化子进行测序鉴定和复筛，也未获得目的序列突变株。 （5）构建了双基因多靶点CRISPR-Cas9敲除载体。针对金针菇pyrG和pFf-egt1启动子序列各选择两个靶点，利用酶切连接的方法将CRISPR各组分连接构成了三个敲除载体：p3301-Legpd-BlpR-Ffgpd-Csy4-FfCas9-pyrG-pFfegt1-1-sgRNA、p3301-Legpd-BlpR-Ffgpd-Csy4-FfCas9-pyrG-pFfegt1-2-sgRNA和p3301-Legpd-BlpR-Ffgpd-Csy4-FfCas9-pyrG-pFfegt1-3-sgRNA，利用ATMT法获得了48株T-DNA区域插入的金针菇转化子，未获得目的靶点突变株。 （6）就pyrG基因编辑情况比较了ATMT法体内CRISPR-Cas9基因编辑和PEG介导的体外CRISPR-Cas9基因编辑。体外基因编辑比体内效率更高，也更适用金针菇。
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