摘要
目的:通过网络药理学结合分子对接技术对当归芍药散治疗肾间质纤维化的主要效应成分、核心疾病靶点进行分析与模拟，预测其潜在作用机制。通过Western Blot、细胞免疫荧光等方法验证当归芍药散含药血清及其有效成分阿魏酸(Ferulic Acid,FA)、芍药苷(Paeoniflorin，PF)能够抑制细胞焦亡，并改善肾间质纤维化，探索该临床常用方的具体分子机制。 方法:第一部分:网络药理学结合分子对接技术预测当归芍药散治疗肾间质纤维化的潜在作用机制:(1)收集当归芍药散和肾间质纤维化核心靶点;(2)网络药理学分析构建成分-疾病靶点网络并进行GO和KEGG富集分析;(3)获取主要效应成分、核心疾病靶点的分子结构并优化模拟对接。 第二部分:体外实验验证当归芍药散治疗肾间质纤维化的分子机制:(1)CCK-8法测定不同浓度当归芍药散含药血清、PF、FA、TGF-β1对NRK-52E细胞的细胞毒性;(2)筛选进行诱导纤维化模型的TGF-β1浓度;(3)筛选抑制细胞焦亡核心分子NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(Nod-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)蛋白表达的 siRNA 序列及浓度;(4)筛选FA、PF治疗纤维化模型细胞的干预浓度;(5)Western Blot检测当归芍药散含药血清及PF、FA对纤维化模型NLRP3、焦孔素D(GasderminD,GSDMD)、促凋亡因子-1(Cysteiny aspartate specific proteinase,Caspase-1)、白介素(Interleukin,IL)18及纤维化蛋白标志物E型-钙黏着蛋白(E-Cadherin)、N型-钙黏着蛋白(N-Cadherin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)的影响作用;(6)通过ELISA试剂盒检测IL-1β的表达情况。(7)免疫荧光检测当归芍药散含药血清及PF、FA对纤维化模型细胞E-Cadherin及NLRP3蛋白的表达的影响作用。 结果:第一部分:(1)共筛选出符合要求的候选中药成分142个:芍药效应成分29个、茯苓效应成分31个，川芎效应成分28个，当归效应成分27个，白术效应成分9个，泽泻效应成分19个，重复成分8个;(2)得到当归芍药散-肾间质纤维化共同靶点180个，通过PPI网络得到核心靶点15个及下级靶点6个，其中多个蛋白与细胞焦亡相关，如PYCARD、NLRP3、IL-18、IL-1 β、Caspase-1等。GO富集分析得到GO条目7101个，其中生物过程条目5650个，细胞组成条目507个，分子功能条目943个;KEGG通路富集筛选得到278条信号通路，主要集中在代谢途径。(3)分子对接模拟FA、PF、月桂酸、十一烷酸、木脂酸、豆蔻酸6种Degree最高的中药主要效应成分和核心靶点蛋白中Degree值及相关性较强的 7 种蛋白(NLRC3、TLR4、NLRP3、CASP1、PYCARD、GSDMD、1L-18)的结合情况。进行对接后显示FA、PF两种化合物对细胞焦亡及其主要效应成分结合能较高，可以作为后续实验中的效应成分对纤维化模型进行药物干预。 第二部分:(1)CCK-8结果显示含药血清浓度在5％时对细胞生存率影响最小;TGF-β1浓度在5 ng/mL以下时细胞存活率大于50％，故筛选TGF-β1浓度为 1 ng/mL 至 5 ng/mL、FA 筛选 50 mM/mL、75 mM/mL、100 mM/mL 三浓度、PF筛选100 mM/mL、150 mM/mL、200 mM/mL三浓度作为可行的干预浓度。(2)不同浓度TGF-β1干预NRK-52E细胞，发现:NLRP3在TGF-β1浓度于1 ng/mL至5 ng/mL范围内，随浓度上升而表达增加,FN、IL-18等蛋白均在TGF-β1浓度为3 ng/mL时达到高点，综合考虑选择以4 ng/mL TGF-β1作为诱导纤维化模型浓度。(3)5 ng/mL浓度的NLRP3-si-3 siRNA序列能够在纤维化模型中显著抑制NLRP3的表达并能增强E-Cadherin的表达(4)75 μmol/mL FA对于纤维化模型NRK-52E细胞中FN、NLRP3、IL-18均有较强抑制作用，且能显著降低FN蛋白的表达情况(P＜0.01);200 μmol/mL PF对于纤维化模型细胞中FN、NLRP3、IL-18均有较强抑制作用(P＜0.01)。(5)使用TGF-β1刺激后，细胞内焦亡相关分子 NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18 及纤维化蛋白标志物 FN、N-Cadherin表达上升,E-Cadherin表达下降，E-Cadherin与N-Cadherin表达比值下降(P＜0.01),高、中、低剂量当归芍药散含药血清及FA、PF均能够降低细胞焦亡蛋白表达情况;对于纤维化蛋白标志物，中、高剂量当归芍药散含药血清及PF、FA均有效降低FN蛋白表达量(P＜0.05)。(6)ELISA检测IL-1β发现:不同剂量当归芍药散含药血清及FA、PF均能有效降低IL-1β的表达(P＜0.01)。(7)双标免疫荧光结果显示:与模型组对比，低、高剂量当归芍药散含药血清及PF、FA治疗后的E-Cadherin蛋白表达显著上升，NLRP3(P＜0.01);中、高剂量当归芍药散含药血清及PF、FA治疗后的NLRP3蛋白表达较模型组显著下降(P＜0.01)。 结论:本实验通过网络药理学及分子对接模拟方法筛选当归芍药散的主要效应成分为阿魏酸、芍药苷，干预肾间质纤维化的潜在作用机制为经典细胞焦亡，并经过实验验证当归芍药散含药血清与主要效应成分阿魏酸、芍药苷在不同剂量下能减轻TGF-β1诱导下NRK-52E细胞的纤维化，这一过程中抑制NLRP3炎症小体所介导的经典细胞焦亡发挥重要作用。
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