摘要
锌簇蛋白作为真菌中特有的一类转录因子，广泛参与真菌中初级和次级代谢、环境胁迫应答和细胞分裂等生命活动的调控。其中锌簇蛋白Cat8p是调控非发酵碳源代谢的关键转录因子。近年来的研究发现Cat8p可能具有非常复杂的自身活性调控模式和转录调控网络，但相关的调控机制还很不清楚。本论文以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为研究对象，从Cat8p核定位和蛋白稳定性的调控机制、Cat8p在氮代谢调控中的功能、以及酿酒酵母不同类群间Cat8p的功能分化等层面开展研究，解析Cat8p的活性调控机制并挖掘其潜在的调控功能，探索其在酿酒酵母多样性进化过程中的作用，研究结果对全面理解Cat8p的调控作用机制和功能进化具有重要意义。 作为转运型锌簇蛋白，Cat8p的转录调控功能与自身亚细胞定位密切相关。本研究利用绿色荧光蛋白基因gfp5为报告基因对影响Cat8p亚细胞定位的因素进行分析，发现Cat8p通过核定位信号993-RLKYEKDAKRNAK-1005介导入核，且核定位过程不受碳源种类的影响。对参与Cat8p磷酸化修饰的蛋白激酶相关基因进行敲除或突变等遗传操作，结果表明Cat8p的核定位过程依赖于Snf1蛋白激酶复合体，其中的β亚基Ga183p不参与Cat8p的核定位，但α催化亚基Snf1p的Thr210位磷酸化是其介导Cat8p入核所必需的。此外，对Cat8p翻译后修饰位点进行突变，发现Cat8p的磷酸化和SUMO化修饰不参与核定位过程的调控。同时，本研究发现Cat8p存在营养响应的稳定性调控机制。通过蛋白酶体抑制和放线菌酮示踪分析，发现Cat8p的降解是在细胞核中通过泛素-蛋白酶体系统进行的。Cat8p的磷酸化和SUMO化修饰参与自身稳定性调控，酵母细胞通过Snf1复合体和TORC1通路来响应环境中碳氮源的可利用性，被激活的Snf1p可磷酸化Cat8p增加其稳定性，而被抑制的TORC1可使Cat8p发生去磷酸化降低其稳定性，因此通过改变Cat8p磷酸化修饰程度来调控其降解速率。上述研究结果扩展了对Cat8p活性调控机制的理解，为进一步解析Cat8p的转录调控新功能奠定了基础。 前期研究发现Cat8p参与以苯丙氨酸为底物的艾氏途径的代谢调控，推测其不但是非发酵碳源代谢的关键转录因子，而且还参与调控细胞的氮代谢。本研究通过比较CAT8缺失或过表达后酵母细胞利用不同氮源生长的表型差异，分析其对氮源代谢的调控作用。发现Cat8p在缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的代谢调控中起激活作用。随后，通过转录组测序、染色质免疫共沉淀测序和免疫共沉淀技术全面解析了 Cat8p在艾氏途径中以苯丙氨酸为底物合成2-苯乙醇的调控机制。结果显示，Cat8p全程参与并全面且广泛的调控了酵母细胞的艾氏途径。在发酵代谢时Cat8p通过增加碳氮代谢通量提高菌体生物量和2-苯乙醇产量;在呼吸代谢时Cat8p直接结合并激活艾氏途径的关键基因（ARO9、BAT2、ARO10和 ADH2）及其上下游相关基因（GAP1、AGP1、BAP2、GAT1、PDR12 和ESPB6)的转录，促进酵母细胞合成2-苯乙醇。并且Cat8p与锌簇蛋白Aro80p和锌指蛋白Gat1p互作，共同调控ARO10的转录。此外，Cat8p不仅参与氮饥饿响应并调控细胞氮代谢（包括氮代谢物阻遏、氮源摄取和氨基酸合成代谢等），还参与调控细胞对多种环境压力的响应。上述研究结果表明Cat8p是一个全局性的转录因子，在调控酿酒酵母适应外界营养和环境压力变化过程中发挥着重要作用。 Cat8p是酵母细胞响应环境营养变化调控碳氮代谢的重要因子，预示着该转录因子可能在酿酒酵母生态环境适应性进化中发挥着重要作用。依据来自59株酿酒酵母不同类群菌株的CAT8序列构建了单基因系统发育树，发现其可以有效区分野生、液体发酵和固体发酵类群，同时中性检验分析表明CAT8受到了正向选择的作用。对基因序列进行分析发现液体发酵和固体发酵类群中CAT8出现了2种以插入缺失和单核苷酸多态性位点划分的高频等位基因，这使得它们的活性调控模式和转录调控功能存在差异。液体发酵类群的Cat8p在调控细胞利用碳氮源生长方面存在优势。固体发酵类群的Cat8p对细胞的调控更加广泛，主要体现在对能量代谢、营养代谢的抑制和对环境压力响应的激活，并且会改变酿酒酵母的形态发育。Cat8p通过提高细胞壁甘露糖蛋白基因CWP1的表达使隔膜稳定性增强，同时降低内切-1，3-β-葡聚糖酶基因DSE4的表达使隔膜降解效率降低，从而导致母子细胞分离受阻，形成多细胞聚集体，增强酵母菌对固体发酵环境的适应性。研究结果进一步扩展了 Cat8p的调控功能网络，同时为理解酿酒酵母驯养类群生态位适应性进化的驱动力提供了新的视角。 本研究通过对Cat8p的活性调控机制、转录调控新功能和适应性进化方面进行研究，不仅扩展了对酿酒酵母营养调控网络和环境压力响应的认知，为改造酵母代谢通路，提高酵母耐受性提供理论指导;而且为探究酿酒酵母驯养史的驱动力提供了新的观点。
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