摘要
天麻素(Gastrodin)是传统中药天麻的主要活性成分，也是原料药的质量评估标准之一。天麻素为主要药物成分的产品已被广泛用于医疗和保健食品领域，但天麻素的生产仍以植物提取法为主。植物提取法弊端较多，如产率低、受自然条件限制多，步骤繁琐、环境污染严重等，这与绿色可持续的发展理念相悖。近年来随着合成生物学和分子生物学的发展，基因编辑技术不断更新，工程改造微生物以适应工业化大生产的生物发酵生产方法逐步走入人们视野。以微生物为底盘细胞来高效合成天麻素将弥补传统天麻素生产方法的不足，实现绿色、高效、可持续的生产。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)作为食品安全级菌株，具有底物谱广、鲁棒性强、不产乙醇等独特的生理和代谢优势。目前Y.lipolytica已被改造为多种功能性脂肪酸、糖醇类化合物及天然产物的工业生产宿主。因此，本研究以Y.lipolytica为底盘菌株，搭建从葡萄糖到天麻素的从头合成途径。基于蛋白质工程、优化胞内代谢网络、抑制产物代谢等策略，进一步提高Y.lipolytica的天麻素积累能力。本研究主要结果具体如下: (1)SlyUGT优势突变体的构建。首先使用计算机模拟蛋白质与底物作用过程，在SylUGT中选择了 8个氨基酸位点进行定点饱和突变，包括PRO135、ALA345、ARG346、SER349、VAL370、HIS371、ASN340、TYR381。构建突变体并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达，以终浓度200 mg/L对羟基苯甲醇和终浓度400 mg/L的UPDG为底物产天麻素，筛选优势突变体。突变体筛选结果表明 SlyUGTN340M(E340-13)、SlyUGTS349E(E349-7)、SlyUGTV370C(E370-5)表达菌株催化效率分别提高20.65％、23.83％、16.21％。随后在菌株Y.lipolytica Po1g中分别表达糖基转移酶SlyUGT及突变体SlyUGTN340M、SIyUGTS349E和SlyUGTV370C,并进行发酵验证。实验结果表明突变体SIyUGTS349E生产了 220.9 mg/L天麻素，与SlyUGT相比，突变体SIyUGTS349E整合菌株的天麻素产量增加了 1.28倍。SIyUGTS349E催化效果最好，用于后期研究。 (2)优化胞内代谢网络促进天麻素的合成。基于前期研究结果发现1(YALI0A16379g)、9(YALI0B10153g)、10(YALI0C08701g)、14(YALI0D15246g)、21(YALI0E18568g)位点具备较高的表达效率和较低的生长抑制性能，因此选1、9、10、14、21位点为天麻素途径整合位点。将天麻素合成途径酶UbiC22-NcCAR-PAR2-SlyUGTS349E四基因表达框在21基因位点进行单拷贝整合，产量达到49.9 mg/L;进一步，为了解除莽草酸途径的反馈抑制，将来自E.coli的DAHP合酶突变体EcaroGF和来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的DAHP合酶突变体ScARO4F表达框整合到14基因位点，产量达到1007.1 mg/L,表明下游氨基酸对DAHP合酶的负反馈抑制已经解除;之后，将天麻素合成途径酶UbiC22-NcCAR-PAR2-SlyUGTS349E四基因表达框先后在1、10基因位点进行拷贝整合，产量达到1622.3 mg/L;最后，优化的天麻素前体UDP-葡萄糖合成途径被整合到9基因位点，最终得到工程菌株YliGT5,天麻素产量增加至4866.9 mg/L。 (3)鉴定天麻素降解关键因素，消除天麻素的降解。胞内代谢优化提高了天麻素的产量，但发酵结果显示细胞中天麻素被迅速降解，基于此，挖掘Y.lipolytica内源20种糖苷酶编码基因，通过单敲除验证20种糖苷酶对天麻素的降解能力。发酵结果显示，糖苷酶 Glu6(YALI0A19074p)和 Glu9(YALI0B14289p)的敲除成功抑制了天麻素的降解，Glu6和Glu9可能是天麻素降解的关键酶。最后利用Cre/loxp系统在重组工程菌株Y.lipolytica YliGT5中敲除Glu6和Glu9得到重组工程菌株YliGT6,发酵结果表明YliGT6菌株在72 h后继续积累天麻素，并将天麻素产量提高至6002.3 mg/L。 综上所述，本文构建了一株重组解脂耶氏酵母工程菌株YliGT6,最终该菌株能够在摇瓶中以80 g/L葡萄糖为底物生产天麻素6002.3 mg/L。后期进一步开发高通量筛选技术，筛选糖基转移酶优势突变体。结合代谢工程策略和发酵工程技术，将有利于天麻素的进一步商业化生产。
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