摘要
凝血酶(TB)是存在于血液中的一种丝氨酸蛋白酶，参与神经炎症、动脉粥样硬化和细胞死亡等病理过程，是疾病预防、临床诊断和新药开发中的生物标志物;在临床上，凝血酶通常用于外伤、烧伤治疗和手术过程中的止血，是一种重要的临床药剂。因此高纯的凝血酶样本是研究其结构-功能关系和有效发挥临床作用的前提基础，开发高效的凝血酶分离方法对其后续研究和实际应用具有重要意义。本论文基于适配体功能化的多孔金属有机框架材料(MOFs),开发了多种分离介质并构建了相应的吸附分离策略，实现了血清、血浆和全血中凝血酶的高效分离。 论文第一章简要介绍了凝血酶和其适配体的结构以及凝血酶的分离方法，概述了MOFs材料和刺激响应聚合材料的分类、制备及应用进展。 论文第二章以聚苯乙烯微球为模板，制备了负载ZnO的大孔SiO2。通过溶解-沉淀过程在大孔SiO2表面原位生长有机框架材料ZIF-8,并利用凝血酶适配体(TBA)对其进行功能化修饰，制备了三维有序大孔复合材料(3DOM SiO2@ZIF-8-TBA)。复合材料的有序大孔结构为蛋白质吸附提供了丰富的活性位点，适配体与蛋白质之间的特异性作用使3DOM SiO2@ZIF-8-TBA材料对凝血酶呈现出良好的吸附选择性，其吸附行为符合Langmuir吸附模型，吸附容量为40.9 U mg-1。采用1.0％NH3·H2O(v/v)可对吸附的凝血酶进行快速洗脱回收。3DOM SiO2@ZIF-8-TBA具有良好的生物相容性，圆二色光谱分析表明基于该材料的吸附分离过程对凝血酶的构象没有影响，纤维蛋白生成实验表明回收的凝血酶仍保留有良好的酶活性。将3DOM SiO2@ZIF-8-TBA材料用于血清中凝血酶的吸附分离，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明得到了高纯的凝血酶样本。 论文第三章制备了一种MOF基“三明治”式夹层膜，构建了“筛分-捕获”串联分离策略实现凝血酶的高效分离富集。基于羧基与Zn2+间的相互作用，将接枝有聚(N-异丙基丙烯酰胺)的海藻酸钠复合物(SA-PNIPAM)包覆在适配体功能化的三维有序大孔有机框架材料3DOM ZIF-8-TBA表面，并通过真空辅助自组装技术制备得到中间层为多孔MOF材料、外层为温敏材料的智能门控MOF膜。MOF膜外层的SA-PNIPAM通过温控尺寸筛分效应赋予膜良好的蛋白质透过选择性，对其他高丰度蛋白(CytC、Lyz、Try、Hb、HSA、Trf)的分离因子为13.88-49.22;同时中间层的大孔结构提供了优异的凝血酶捕获能力，在TB/HSA浓度比为1∶1000时,膜对TB的富集因子高达95.97。“筛分-捕获”串联分离策略有效地避免了血清样品中大分子蛋白质组份的干扰，简化了洗脱过程，提升了 MOF材料孔结构内活性位点的利用效率，凝血酶的吸附容量提高到 60 U mg-1。 论文第四章通过酰胺化反应将具有pH响应的微凝胶聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸）（P（NIPAM-MAA））共价交联于混合纤维素酯（MCE）膜表面，并通过真空辅助自组装将适配体功能化的ZIF-8/氧化石墨烯膜沉积在MCE膜上，制备了具有pH响应的双层分离膜（MCE/ZGO膜）。pH响应微凝胶的“尺寸-电荷”双筛分作用使MCE/ZGO膜对尺寸较大的蛋白质和尺寸较小的氨基酸分子均呈现出良好的筛分去除效应，对血浆中高丰度蛋白质组份HSA、Trf、Hb、CytC和氨基酸组份His、Cys、Lys的分离因子在22-51之间。因该MCE/ZGO膜可有效去除样品中其他蛋白质组份和氨基酸分子的干扰，因此可直接用于未稀释血浆样品中凝血酶的吸附分离，消除了因样品稀释带来的回收率下降问题。S-2238底物显色和纤维蛋白生成实验均表明从未稀释血浆样品中分离得到了较高活度的凝血酶样本。 论文第五章基于光可逆DNA纳米开关功能化的MOF气凝胶，构建了一种无洗脱剂的凝血酶分离策略。将温度/pH双响应聚醚砜（PES）填料和光响应型DNA纳米开关功能化的MOF气凝胶（DNA@MOF气凝胶）依次填入玻璃管制成用于凝血酶分离的串联柱。全血样品在经过温度/pH双响应PES填料的筛分作用去除主要干扰组份后，通过偶氮苯在紫外光（365 nm）和蓝光（450 nm)照射下的顺反异构化控制的DNA纳米开关功能，实现凝血酶在DNA@MOF气凝胶上的特异性捕获和免洗脱式释放。所构建的无洗脱液分离方法可直接处理全血样品，血液中的血细胞等固体杂质不产生影响，简化了样品前处理过程，且避免了常规分离过程中化学洗脱剂带来的酶活损失风险。色谱分析表明全血中分离得到的凝血酶纯度高于95％，且具有良好的储存稳定性（长达1个月）。 论文第六章总结了本论文的相关研究内容，展望了更高效、准确的凝血酶等低丰度蛋白的潜在分离策略和MOF材料在蛋白质分析中的应用前景。
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