摘要
肝纤维化是世界范围内常见的健康问题，其发病率较高。肝脏受到损伤后，损伤因子持续刺激，创面愈合异常，造成细胞外基质过度增生和大量沉积，进而造成肝脏纤维性瘢痕的形成。如果不及时加以治疗，肝纤维化可发展为肝硬化乃至肝癌等。目前肝纤维化缺乏有效的治疗手段，主要通过一些抗炎、保肝等药物来延缓疾病的进程。 本文利用细胞实验，对丹酚酸B和壳聚糖对大鼠肝星状细胞的细胞毒性以及抑制细胞增殖的能力进行了考察，同时通过四氯化碳诱导建立小鼠肝纤维化模型，首先筛选了丹酚酸B的给药途径以及壳聚糖的分子量，选择合适的给药剂量进行联合应用，采用组织病理学、RT-qPCR、免疫组化以及Western Blot等手段，初步评价丹酚酸B联合壳聚糖治疗四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的效果，研究肠道菌群在联合治疗中的作用，并探讨其可能的机制，为联合治疗在肝纤维化领域的应用提供实验支撑。 实验结果如下: （1）本文进行了丹酚酸B和壳聚糖对大鼠肝星状细胞的毒性和抑制增殖测定。研究发现在10-50μM的浓度范围下，丹酚酸B未发现细胞毒性，而当浓度为100μM时展现出了一定细胞毒性，当浓度高至200,400,500 μM时，细胞活力极大幅度下降。而对于壳聚糖，3.125-1600 μg/mL的浓度范围内都是其安全浓度，在此范围内壳聚糖对肝星状细胞不具备细胞毒性。同时，丹酚酸B在浓度为10-50 μM时能抑制已活化的肝星状细胞增殖，而壳聚糖则在100以及400 μg/mL的浓度下能抑制细胞的大量增殖，提示丹酚酸B和壳聚糖都能在体外对肝星状细胞的增殖起到抑制作用。 （2）本文利用CCl4作为诱导剂，建立了化学性肝纤维化小鼠模型，通过血清生化指标检测以及肝脏组织病理学分析，发现CCl4对肝脏造成了严重损伤，显著升高血清中AST和ALT的水平，使得肝脏形态发生明显变化，导致胶原纤维在肝脏中过度沉积，并加重炎性细胞对肝脏的浸润。其次，我们利用肝纤维化小鼠进行了丹酚酸B不同给药方式的研究，发现丹酚酸B治疗肝纤维化的效果良好。同时，灌胃和尾静脉的给药方式都能使小鼠肝纤维化的症状减轻，降低血清中转氨酶的水平，改善肝脏的形态和组织病理学结果。同时，尾静脉注射的给药方式抗肝纤维化效果与阳性药（水飞蓟素）组相似，在改善肝纤维化症状方面的能力可能优于灌胃给药。 （3）本文对不同分子量壳聚糖（Mw≤ 1，50和100k-Da）改善肝纤维化小鼠相关指标的作用进行了评价，结果显示壳聚糖对四氯化碳所致的小鼠肝纤维化疗效良好，能有效改善肝纤维化小鼠的症状，降低血清AST和ALT水平。并且不同分子量壳聚糖都能减轻炎性细胞在肝脏的浸润，减少胶原纤维在肝脏的面积，改善肝脏的炎症情况和纤维化情况，但不同分子量的壳聚糖抗肝纤维化的作用未见明显差异。同时，我们对肝纤维化小鼠体内肠道菌群的变化进行了分析，发现壳聚糖能改善肝纤维化小鼠体内肠道菌群的组成，提高有益菌的比例，但1k-Da分子量的壳聚糖能使肝纤维化小鼠的菌群组成更接近正常组。 （4）本文对丹酚酸B和壳聚糖进行了联合应用研究，探讨了二者联用较单独治疗对肝纤维化的效果差异;同时设置了伪无菌给药小鼠组别，研究肠道菌群在肝纤维化治疗中的可能机制。通过血清生化指标发现丹酚酸B和壳聚糖联合应用可以改善肝纤维化小鼠的肝脏受损症状，降低AST和ALT水平，组织病理学提示联合治疗能减轻胶原纤维的沉积，减少炎性细胞在肝脏的浸润，效果优于单独治疗。分子生物学结果显示，与单独给予丹酚酸B和壳聚糖相比，联合治疗能够更有效地下调肝纤维化小鼠肝脏组织中α-SMA、COLI、TIMP-1、IL-1β等基因的mRNA表达水平，并降低α-SMA和COLⅠ蛋白在肝脏中的表达，抗肝纤维化能力较单独治疗更好。16S rRNA测序分析发现丹酚酸B和壳聚糖联合治疗能改善肝纤维化小鼠体内肠道微生物的组成和比例，升高因肝脏受损而下降的有益菌如Bacteroidota的比例，而降低有害菌如Actinobacteria的丰度，并且提升了肝纤维化小鼠肠道内总体微生物的物种丰富度和群落均匀度，调节紊乱的肠道菌群趋于正常。利用伪无菌小鼠模型研究发现，在用抗生素干预后，各给药组均较未使用抗生素干预的组别疗效有所下降，在小鼠体重增长、降低血清AST水平方面与模型组比无统计学意义，降低α-SMA和COL Ⅰ蛋白在肝脏中的表达的能力弱于正常给药组，提示肠道菌群中有益菌的升高在肝纤维化的治疗过程中可能起到了积极作用。 综上所述，丹酚酸B联合壳聚糖在四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型中体现出了良好的治疗效果并优于单独治疗，联合治疗能够显著降低小鼠血清中AST、ALT的水平，下调α-SMA、COLⅠ以及与炎症相关的IL-1β、TIMP-1等基因的水平，降低COL Ⅰ和α-SMA蛋白在肝脏中的表达，改善肠道内共生微生物群落的紊乱状态。通过“肠-肝轴”发挥作用可能是丹酚酸B联合壳聚糖治疗肝纤维化的重要药效机制之一。
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