摘要
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于单股正链RNA病毒，可引起牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea/Mucosal disease，BVD/MD），该病致死率较高，且能够在群体中持续性感染，严重威胁规模化养殖业的发展和生物制品安全。早期应答基因 3（Immediate early response 3，IER3）是一种应激诱导基因，在细胞增殖、分化等过程以及免疫反应中发挥重要作用。本课题组前期研究发现 BVDV 感染会使IER3基因显著性高表达；同时有研究显示BVDV感染诱导IER3表达进而阻断NF-κB通路的信号传导；所以IER3可能是BVDV复制过程中的关键基因，但其是否影响 BVDV 复制及具体作用机制尚未见报道。本研究拟对以上问题进行研究，以期阐明BVDV感染复制的机制、研发防控BVD的药物和疫苗提供理论依据。 1．IER3调控内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）影响 BVDV胞内复制。构建IER3过表达的MDBK细胞（Myc-IER3）；BVDV毒株TC感染Myc-IER3细胞，利用免疫荧光染色、致细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）、实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）及病毒滴度测定等检测BVDV复制情况；通过电镜、qRT-PCR和Western Blot探究BVDV和IER3对ERS的影响，进一步利用 ERS 抑制剂 4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）和诱导剂毒胡萝卜素（Thapsia garganica，TG），探究IER3通过ERS影响BVDV复制。结果显示： BVDV感染Myc-IER3细胞后，BVDV 5ʼUTR mRNA、dsRNA及子代病毒滴度显著性升高，CPE 现象增强；BVDV 感染 MDBK 细胞后内质网形态扩张，随后出现破碎；BVDV感染和IER3过表达都激活ERS中的PERK-EIF2α-ATF4通路；抑制ERS后BVDV复制能力降低；反之，促进ERS复制能力增强；抑制ERS减弱IER3对BVDV复制的作用，而激活 ERS增强 IER3对 BVDV复制的作用。表明 IER3激活 ERS的 PERK-EIF2α-ATF4通路，促进BVDV复制。 2．IER3 调控分泌转运蛋白 62（Secretory translocation protein 62，SEC62）。利用TurboID邻近蛋白标记系统筛选与 IER3相互作用的蛋白；通过 Pull down和 Co-IP验证IER3与SEC62的相互作用；使用Zdock和Amber18软件进行分子对接及动力学模拟；MMPBSA.py软件计算每个氨基酸的贡献；对贡献较高的位点进行同源性对比和定点突变，验证突变后蛋白互作情况；利用qRT-PCR和Western Blot检测IER3过表达后SEC62的表达情况。结果显示，IER3 的互作蛋白主要富集在糖蛋白代谢、ERS 及蛋白质折叠等通路；IER3 与 SEC62 蛋白的 N 端进行相互作用；两者之间的结合自由能为-483 kcal/mol，静电作用为-111 kcal/mol，范德华势能为-56 kcal/mol；定点突变后发现 IER3的A15、D144氨基酸残基和SEC62的F30、P191氨基酸残基是两蛋白互作的关键位点；过表达 IER3基因后 SEC62 mRNA和蛋白表达水平均显著升高。表明 IER3诱导 SEC62表达，且与SEC62存在相互作用。 3．SEC62 调控内质网自噬促进 BVDV 复制。构建过表达 SEC62 的 MDBK 细胞（mCherry-SEC62）；BVDV毒株 TC感染 mCherry-SEC62细胞，使用免疫荧光染色、qRT-PCR及病毒滴度测定等方法检测BVDV复制情况；利用电镜、qRT-PCR和Western Blot检测BVDV和SEC62对自噬的影响；利用巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1，BafA1）抑制自噬、饥饿诱导自噬，探究自噬对 BVDV 复制的作用，以及 SEC62 通过自噬对BVDV复制的影响，利用 Zdock软件建立分子对接模型，Pull down和 Co-IP验证 LC3B和 SEC62 的相互作用。结果显示：BVDV 感染后，mCherry-SEC62 细胞中的 BVDV 5ʼUTR mRNA、dsRNA 及子代病毒滴度显著性升高；电镜检测 BVDV 感染后细胞内出现大量自噬小体；且BVDV感染和过表达SEC62能够激活细胞自噬；抑制细胞自噬抑制BVDV复制，促进细胞自噬增强BVDV复制；BafA1处理mCherry-SEC62后，阻碍SEC62对 BVDV复制的促进作用，而诱导自噬可增强 SEC62对 BVDV复制的促进作用；分子对接、Co-IP 和 Pull down 结果显示 SEC62 和 LC3B 存在相互作用。表明过表达SEC62激活细胞自噬，SEC62与LC3B互作引起内质网自噬，促进BVDV复制。 4．过表达 IER3 促进 BVDV 在 BALB/c 小鼠体内的增殖。BVDV 毒株 TC 感染BLAB/c小鼠建立感染模型，利用 qRT-PCR检测 BVDV和 IER3 mRNA表达情况；病理切片检测各组织病变情况；包装rAdv-IER3重组腺病毒，建立IER3过表达小鼠模型，通过临床表征和病理切片检测重组腺病毒的安全性，qRT-PCR检测 IER3 mRNA的表达；BVDV毒株TC感染IER3过表达小鼠，探究IER3过表达对BVDV体内复制的影响。结果显示：在 BVDV 感染后期，BLAB/c 小鼠的体重显著性降低；各组织中的 BVDV拷贝数显著性升高；大部分组织出现不同程度的病理损伤，IER3 mRNA 水平显著性升高；rAdv-IER3重组腺病毒感染 BLAB/c小鼠后，小鼠体重、体温和精神状态没有明显变化，病理切片未见明显病变，但各组织中 IER3 mRNA水平极显著性升高；BVDV感染过表达IER3的BALB/c小鼠后，与对照组相比rAdv-IER3组中各组织BVDV拷贝数显著性升高，病变更为严重。表明过表达IER3促进BVDV体内复制。 结论：IER3引起ERS，促进SEC62表达，并与SEC62的N端互作；SEC62的C端与LC3B互作激活内质网自噬；IER3通过ERS引起的内质网自噬促进BVDV复制。
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