摘要
目的:三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen的干燥根及根茎。2020年版《中国药典》记载其具有散瘀止血，消肿定痛的作用。三七发挥药效的主要活性成分是三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponin,PNS），由三七的主根或根茎中提取加工制成，其主要成分包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd。三七及其制剂临床上除应用于心、脑血管疾病外，也广泛应用于治疗急、慢性肺损伤。前期课题组研究发现，口服及尾静脉注射PNS可以降低由脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）小鼠的肺组织炎性浸润程度，并可改善其肺功能，具有较好的防治ALI的作用。PNS 口服生物利用度低，注射剂的应用又受到诸多限制。吸入给药可控制雾化液滴的粒径将药物直接递送至肺部，是目前治疗肺部疾病常用的给药方式。脂质体材料具有良好的生物相容性且既可以包裹脂溶性药物又可以包括水溶性药物，因此本研究以PNS为模型药物，采用微流控技术制备三七总皂苷脂质体（PNS Liposomes,PNS-Lip）肺部吸入制剂，并复制ALI动物模型，评价雾化吸入PNS-Lip治疗ALI的可行性。 方法:（1）雾化吸入PNS溶液对LPS诱导的ALI小鼠模型的药效作用评价: 以LPS诱导的ALI小鼠为模型，考察PNS溶液雾化吸入与静脉注射两种给药方式对ALI小鼠的药效作用。采用全身体积描记系统（Whole Body Plethysmography,WBP）记录小鼠的肺功能;利用恒重法测定肺组织湿重/干重比值检测小鼠的肺水肿情况;采用二喹啉甲酸法（Bicinchoninic Acid,BCA）检测小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）中总蛋白浓度;采用酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测小鼠BALF中炎症因子白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的变化情况;将固定好的肺组织进行石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin Staining,HE）染色，并使用显微镜观察并拍照检测小鼠肺组织损伤情况。 （2）PNS-Lip 的制备: 采用微流控技术制备PNS-Lip,以包封率（Encapsulation Efficiency,EE）和载药量（Drug Loading,DL）为指标，对制备过程中醇相与水相总流速及流速比、卵磷脂与胆固醇的总浓度及比例、稀释液体积以及PNS浓度等影响因素进行单因素考察，最终确定微流控技术制备PNS-Lip的最佳处方与工艺条件。 （3）PNS-Lip制剂学评价: 利用马尔文激光粒度仪检测PNS-Lip混悬液的粒径、PDI和Zeta电位;利用生物透射电子显微镜（Transmission electron microscope examination,TEM）观察PNS-Lip的亚显微结构;利用透析袋法考察48 h内PNS-Lip体外累积释药情况;利用马尔文粒径仪对PNS-Lip储存稳定性进行初步评价，考察PNS-Lip适宜保存温度;利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测PNS-Lip在成人呼吸模式下的递送速率和递送总量;利用新一代药用撞击器（Next Generation Pharmaceutical Impactor,NGI）分析检测 PNS-Lip 雾化空气动力学分布特性（Aerodynamic Particle Size Distribution,APSD）。 （4）空白脂质体吸收及摄取机制初步研究: 在空白脂质体表面标记荧光，以A549细胞作为肺上皮细胞模型，荧光显微镜观察细胞内荧光强度，比较孵育时间、孵育温度和不同内吞抑制剂对空白脂质体摄取的影响，并初步探讨其可能的吸收转运机制。 （5）PNS-Lip雾化吸入对LPS诱导的ALI小鼠药效学评价: 以LPS诱导的ALI小鼠为模型，考察PNS同等剂量下尾静脉注射、雾化吸入PNS溶液以及雾化吸入PNS-Lip对ALI小鼠肺功能、BALF中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平、病理损伤情况等的影响，从而研究PNS-Lip雾化吸入的药效作用。 （6）PNS-Lip雾化吸入初步安全性评价: 使用大鼠空白血浆提取的红细胞进行PNS-Lip溶血实验，对PNS-Lip体外安全性进行考察。此外，利用小动物口鼻雾化暴露装置对正常小鼠进行PNS-Lip雾化，检测小鼠肺功能、肺组织湿重/干重比值、观察肺组织组织病理切片并与空白小鼠做对比，对PNS-Lip雾化吸入进行体内吸入刺激性评价。 结果:（1）PNS溶液雾化吸入对LPS诱导的ALI药效作用评价: PNS尾静脉注射及雾化吸入对于LPS诱导的ALI小鼠均具有一定的治疗作用。尾静脉注射给药在50 mg·kg-1、100 mg·kg-1剂量下表现出显著改善LPS诱导的ALI小鼠的肺功能、肺组织水肿、肺组织炎性浸润及损伤等作用，而雾化吸入PNS溶液给药剂量在25mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg1下同样表现出显著的改善作用，且当给药剂量分别为50mg·kg-1、100 mg·kg-1时，同等剂量下两种给药方式对LPS诱导的ALI小鼠肺功能、肺组织水肿、肺组织炎性浸润及损伤等改善作用相似。 （2）PNS-Lip 的制备: 经单因素实验考察，确定微流控技术制备PNS-Lip的工艺为:称取卵磷脂和胆固醇按4∶1的比例共溶于乙醇中，构成醇相;称取PNS溶于纯水中，构成水相。其中卵磷脂浓度为48 mg·mL-1,胆固醇浓度为12 mg·mL-1,PNS浓度为60 mg·mL-1。将醇相和水相分别通过注射器以总流速为1 mL min-1、1∶4的流速比注入微流控通道后注入2倍前体溶液体积的纯水稀释液中稳定脂质体，200 rpm磁力搅拌2 h挥干乙醇后即得带淡蓝色乳光的PNS-Lip混悬液。 （3）PNS-Lip制剂学评价: 制得的 PNS-Lip 其粒径为 102.87±0.52 nm,PDI 为 0.10±0.01，电位为-19.93±2.38 mV;DL为64.14±0.89％;TEM下观察PNS-Lip的微粒形态为圆形或类圆形，并且其分散性良好。48 h内，PNS-Lip在pH 7.4释放介质中的累积释放度为59.02±2.09％,明显低于PNS溶液的释放量，PNS-Lip的释放符合一级动力学方程。成人呼吸状态下PNS-Lip的递送速率为1.02 mg·min-1,2 mL PNS-Lip的递送总量为10.16 mg,利用NGI圆盘撞击器对PNS-Lip的APSD进行考察，采样2 min其肺部沉积量约为1.72 mg,微细粒子分数（Fine Particle Fraction,FPF）约为75.26％。初步稳定性实验显示PNS-Lip 30天内置于4℃可稳定存在。 （4）PNS-Lip吸收及摄取机制初步研究: A549细胞对荧光标记的空白脂质体的吸收摄取存在时间与温度依赖性，吸收摄取受甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin,M-β-CD）、5-（N-乙基-N-异丙基）阿米洛利（Ethylisopropylamine,EIPA）、氯丙嗪（Chlorpromazine，CPZ）的影响，提示A549细胞对于荧光标记空白脂质体的吸收摄取与网格蛋白介导的内吞作用、小窝介导的内吞作用以及细胞巨胞饮作用均存在一定的关系。 （5）PNS-Lip对LPS诱导的ALI小鼠药效学评价: 尾静脉注射PNS溶液（i.v.-PNS）、雾化吸入PNS溶液（inh-PNS）以及雾化吸入PNS-Lip（inh-PNS-Lip）在50 mg·kg-1均可明显改善LPS诱导的ALI小鼠的肺功能、肺水肿、降低BALF中促炎因子IL-6、IL-1β及TNF-α的表达及减少肺组织损伤。从肺组织水肿程度来看，三者作用趋势为inh-PNS-Lip＞inh-PNS＞i.v.-PNS,雾化吸入PNS-Lip与PNS溶液的两种给药方式相比在其他炎症指标上均无明显统计学差异，需进行进一步的实验研究。 （6）PNS-Lip初步安全性评价: 在5-60 μg·mL-1浓度范围内，PNS-Lip的溶血率在溶血临界安全范围之内，说明PNS-Lip的血液相容性良好。对PNS-Lip的体内吸入刺激性进行评价，PNS-Lip雾化吸入对正常小鼠的肺功能无明显影响，亦不会引起小鼠的肺水肿，因此综合PNS体内及体外安全性评价结果，本研究初步认为实验制备的PNS-Lip安全、无明显毒性。 结论:本研究采用微流控技术以PNS为模型药物成功构建了 PNS-Lip吸入给药系统，制备的PNS-Lip粒径较小且分散性良好，有较高的EE和DL，可实现肺部有效递送以及规模化生产，且具有较好的稳定性。雾化吸入PNS-Lip能够显著改善LPS诱导的ALI小鼠的肺功能，抑制小鼠的肺组织水肿及BALF总蛋白浓度，并且能够减轻小鼠肺部炎症因子表达及抑制小鼠肺损伤，并具有较好的体内安全性。本研究为注射用血栓通新的给药途径以及增加新的临床适应症等研究提供了实验基础，同时也为其他中药吸入制剂的研究模式提供参考。
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