摘要
目的:基于蛋白质质谱（Protein Mass Spectrometry）与网络药理学（Network Pharmacology）研究宣肺通腑方（Xuanfei Tongfu Recipe，XTR）治疗急性肺损伤（acute lung injury,ALI）的潜在通路和相关靶点，通过体内外实验对其进行实验验证，探究XTR治疗ALI的作用机制。 方法:（1）基于液质联用技术对XTR化学成分进行分析。用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导C57BL/6J雄性小鼠ALI模型，基于蛋白质质谱技术对小鼠肺组织进行分析。（2）通过网络药理学方法对XTR治疗ALI进行研究。（3）选取XTR质量标志物成分，与蛋白质质谱、网络药理学得出的潜在通路相关靶点进行基于热力学的分子对接研究，得到XTR治疗ALI的关键靶点并进行生物学验证。体内实验:模型同（1）。Western Blot和免疫组化法检测小鼠肺组织mTOR信号通路相关靶点蛋白和蛋白阳性面积表达。（4）体内实验:用ELISA法检测小鼠血浆炎症因子水平，HE染色观察肺组织病理学损伤，使用试剂盒检测生化指标表达，RT-qPCR、Western Blot和免疫组化法检测关键靶点mRNA、蛋白和蛋白阳性面积表达。（5）体外实验:采用LPS诱导J774A.1巨噬细胞炎症模型,ELISA法检测细胞蛋白裂解液上清炎症因子的含量，RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光染色法检测细胞关键靶点mRNA、蛋白和荧光强度表达。经小干扰RNA（SiRNA）介导的FIP200抑制以及过表达FIP200实验后,RT-qPCR和Western Blot法检测细胞Parkin、PINK1和PARP1 mRNA和蛋白表达。 结果:（1）对XTR药液中的化合物进行分析，共鉴定出279种成分。蛋白质质谱结果提示XTR治疗ALI可能与mTOR信号通路、自噬-动物和线粒体自噬-动物有关。（2）网络药理学研究结果提示TNF信号通路、自噬-动物和mTOR信号通路等信号通路。（3）分子对接结果提示XTR质量标志物成分（大黄酸、双醋瑞因、芦荟大黄素、大黄素和苦杏仁苷）与ALI潜在通路相关靶点（mTOR、FIP200、Parkin、PINK1和PARP1）均有较佳的结合能力。体内实验:Western Blot和免疫组化实验提示，除p-ATG13蛋白表达降低、无显著差异外，XTR可降低LPS诱导C57BL/6J 小鼠肺组织 SEH1L、p-mTOR、p-ULK1 和 FIP200 蛋白表达（P＜0.05），及以上各指标蛋白阳性表达面积表达（P＜0.05）。（4）体内实验:Elisa实验表明，地塞米松（Dexamethasone，DEX）与XTR可降低血浆各炎症因子表达（P＜0.01）。HE染色结果显示，与模型组相比，DEX（5mg/kg/d）、XTR（10.92g/kg/d）和XTR（16.38g/kg/d）组肺组织结构完整性部分恢复，局部炎症区域的细胞浸润现象有所减轻。生化指标检测结果提示，与模型组相比，DEX（5mg/kg/d）、XTR（10.92g/kg/d）和XTR（16.38g/kg/d）组各指标表达升高（P＜0.05）。RT-qPCR研究结果表明，与模型组相比，DEX与XTR可显著降低FIP200、Parkin、PINK1、PARP1 mRNA表达（P＜0.01）。Western Blot实验研究发现，与模型组相比，XTR（10.92g/kg/d）组Parkin和PARP1蛋白表达降低（P＜0.05），PINK1蛋白表达降低，无明显差异。XTR（16.38g/kg/d）组各指标蛋白表达降低（P＜0.05）。免疫组化结果表明，与模型组相比，DEX可降低各指标蛋白阳性表达（P＜0.05），XTR（10.92g/kg/d）和XTR（16.38g/kg/d）组Parkin蛋白阳性面积降低、无明显差异，XTR可降低PINK1、PARP1蛋白阳性面积表达（P＜0.05）。（5）体外实验根据CCK8研究结果，设置细胞实验XTR浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。Elisa研究结果表明，与模型组相比，除XTR（50μg/mL）组IL-6表达下降、无明显差异外，其余不同剂量组各炎症因子含量显著下降（P＜0.01）。RT-qPCR结果提示，与模型组相比，XTR 三个剂量组 FIP200、Parkin、PINK1、PARP1 mRNA 表达显著下降（P＜0.01）。Western Blot实验提示，与模型组相比，XTR（50μg/mL）组FIP200和PARP1蛋白表达显著降低（P＜0.01），Parkin、PINK1蛋白表达降低、无明显差异。XTR（100μg/mL）和XTR（200μg/mL）组各指标蛋白表达下降（P＜0.05）。免疫荧光染色法结果显示，与模型组相比，除XTR（50μg/mL）组Parkin、PINK 1和PARP1荧光强度降低但无差异外，其余不同剂量组各指标荧光强度均显著降低（P＜0.01）。SiRNA介导的FIP200抑制以及过表达FIP200实验中，RT-qPCR与Western Blot实验提示，与 XTR（200μg/mL）组相比，Si-FIP200+XTR（200μg/mL）组 Parkin、PINK1、PARP1mRNA 及蛋白表达降低（P＜0.05），OE-FIP200+XTR（200μg/mL）组mRNA及蛋白表达显著升高（P＜0.01）。 结论: （1）蛋白质质谱与网络药理学分析结果提示XTR治疗ALI可能与mTOR通路、自噬和线粒体自噬有关;（2）分子对接结果进一步证实蛋白质质谱与网络药理学分析结果;（3）体内实验验证XTR可以通过调节mTOR通路相关靶点改善ALI炎症反应;（4）体内外实验提示XTR可以通过调节FIP200、Parkin、PINK1和PARP1,从而影响自噬和线粒体功能的稳定，进而调节细胞对炎症和应激的反应，对ALI产生治疗作用。
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