摘要
黄芩属（Scutellaria L.)作为唇形科的第二大植物类群，在世界范围内分布广泛，具有悠久的药用历史。黄芩属植物中富含具有C-6/8位羟基的黄酮类（如黄芩素、去甲汉黄芩素）与黄烷酮类化合物（红花素、异红花素等），目前已报道了黄芩与半枝莲中CYP82D亚家族成员对白杨素与芹菜素底物具有F6H/F8H催化功能，黄芩素等黄酮类成分的生物合成途径已基本阐明。但以黄烷酮为底物的C-6/8位羟基化修饰机制研究较少，CYP82Ds成员是否能够催化黄烷酮类化合物实现C-6/8羟基化尚不清楚。植物的次生代谢产物与其药用物质基础紧密相关，黄芩属植物中黄酮类成分含量丰富，属内特征性C-6/8位羟基化黄酮类成分结构多样，而不同结构的化合物在药理活性方面往往存在较大差异，探明其中黄酮类成分的化学多样性及其形成机制对于该属药用植物的品种培育、精准栽培及资源利用具有重要价值。 随着基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学等的快速发展，多组学结合的研究策略已成为生物合成途径解析与关键基因挖掘的有效手段。因此，本课题以黄芩中已报道的4'-脱氧黄酮（根特异性黄酮类途径）与4'-羟基化黄酮（地上部位特异性黄酮类途径）两条生物合成途径为基础，以属内22个黄芩属物种及不同组织间的代谢差异为导向，探究黄芩属中黄酮类成分化学演化与基因家族功能进化之间的内在联系。本研究旨在通过扩充药用植物谱系的代谢网络、完善黄芩属黄酮类成分的生物合成途径、探究关键结构修饰酶的作用机制，以揭示药用植物内在品质形成的科学内涵，为药用资源的合理开发提供参考。 本研究基于采集的转录组数据对22个黄芩属物种进行分子系统学分析，基于低/单拷贝基因集构建了系统进化树。系统进化树将22个黄芩属物种分为2个分支（Clade-α与Clade-β）,与目前黄芩属分类结果较为一致。进一步使用UPLC-Q-TOF-MS对于22个黄芩属物种的不同组织部位（根、叶）进行了代谢组数据采集,基于分子系统学的分组结果结合多元统计分析对两个分支物种中的黄酮类成分的结构特征进行筛选。多元统计分析结果显示黄芩所在的Clade-α中C-6/8位羟基化的黄酮类成分更为丰富，而半枝莲所在的分支Clade-β暴露出了更为多样的C-2'/6'位羟基化以及硫酸化修饰的黄酮类结构。针对所筛选的结构特征构建母离子列表以实现对黄酮类成分的快速筛选，共鉴定出254种黄酮类化合物。以黄烷酮与黄酮的两类苷元为基础，结合羟基化、O-甲氧基化、糖基化以及O-硫酸化等后修饰类型，构建了黄芩属植物的黄酮类成分代谢网络。发现基于黄烷酮与黄酮两类骨架的C-6/8位羟基化修饰差异是造成物种间代谢轮廓分化的关键节点。构建了 22个黄芩属物种中CYP82D亚家族基因的系统进化树，发现该亚家族基因共分化为5 个分支（CYP82D504、CYP82D506、CYP82D507、CYP82D509、CYP82D511）通过对黄芩与半枝莲中19条CYP82Ds基因所编码的蛋白进行体外功能表征，发现分属于5个分支的CYP82Ds基因出现了明显的功能分化。除已报道的基于黄酮骨架的F6H/F8H催化功能外，本研究发现黄芩中SCBaiCYP82D511与半枝莲中SCBar82D511a编码的蛋白能以柚皮素（黄烷酮）为底物行使F6H和F8H催化功能，同时生成C-6位羟基化产物（红花素）与C-8位羟基化产物（异红花素），且以红花素为主要产物。此外，本研究首次在细胞色素P450家族中发现了基于黄酮类底物具有7-O-去甲基化功能的黄芩SCBaiCYP82D511基因，并选取了不同结构特征的底物进行酶功能验证以探究其底物选择性和催化特点，其特异性消除C-7位甲基取代以便于后续糖基化反应的特性可能是促成黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷等活性成分大量积累的“隐藏开关”。 在本研究中，CYP82D亚家族基因表现出的功能分化特点是造成的黄芩属黄酮类成分多样性形成的关键驱动力。这种以代表性药用植物为切入点，结合属内植物类群的联合分析方法进一步扩充了黄酮类成分的生物合成途径网络，在分子层面上揭示了黄芩属植物中黄酮类成分的化学多样性及其种间差异的形成机制，可为后续黄酮类天然产物的发现、新颖合成生物学基因元件的挖掘，以及黄芩属药用植物资源的开发利用提供参考。
NETL