摘要
目的: 临床上糖尿病溃疡发病率高，易复发，治疗难度大，本研究旨在观察紫朱软膏治疗非缺血性糖尿病足溃疡患者的疗效及其治疗前后铁死亡相关指标的表达差异，评价紫朱软膏的临床疗效及使用安全性;通过观察紫朱软膏作用于糖尿病溃疡小鼠模型，以及紫朱软膏醇提物作用于高糖环境下RSL-3诱导的血管内皮细胞铁死亡模型，由此探索铁死亡对于糖尿病溃疡愈合的影响，以及紫朱软膏可能通过抑制细胞铁死亡促进创面愈合的作用和机制。 方法: 1采用随机对照临床试验，将患者随机分为治疗组和对照组。治疗组采用紫朱软膏油纱布外用治疗，对照组采用贝复济联合凡士林油纱布外用治疗，每天换药1次，治疗8周。在治疗前和治疗后8周，比较两组患者的临床疗效、溃疡面积、DMIST量表评分、创面组织MDA和GSH含量的变化;在治疗前和治疗后8周，比较治疗组创面组织GPX4、SLC7A11、TFRC、VEGF免疫组化的变化。治疗期间记录患者不良反应，治疗后进行安全性评价。 2体内实验将48只C57/BL6J小鼠随机分为四组:正常空白溃疡组（NU）、糖尿病溃疡组（DU）、糖尿病溃疡紫朱软膏治疗组（DUZ）、糖尿病溃疡贝复济治疗组（DUB）。NU组、DU组创面均不进行干预，DUZ组给予紫朱软膏外用干预，DUB组给予贝复济外用干预，每天换药1次，共14天。分别在干预第1、3、7、14天，观察比较各组的创面愈合率、创面组织病理（HE、Masson染色）变化;在干预第3天，观察比较NU组、DU组、DUZ组透射电镜下小鼠溃疡肉芽组织的线粒体微观结构;在干预第14天，检测比较各组创面组织MDA、GSH含量，GPX4、SLC7A11、TFRC、VEGF的mRNA水平和蛋白表达量的差异。 3体外实验构建高糖下RSL-3诱导的血管内皮细胞（HUVEC细胞）铁死亡模型，采用CCK-8法明确合适的药物作用浓度。细胞实验设为八组:正常对照组（Control）、高糖组（glucose）、铁死亡诱导剂 RSL-3+高糖组（RSL-3+glucose）、紫朱软膏醇提物+高糖组（ZZO+glucose）、紫朱软膏醇提物+铁死亡诱导剂RSL-3+高糖组（ZZO+RSL-3+glucose）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1+高糖组（Ferrostatin-1+glucose）、铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1+铁死亡诱导剂 RSL-3+高糖组（Ferrostatin-1+RSL-3+glucose）、甘露醇高渗对照组（Mannitol）。干预后检测比较各组细胞Fe2+、MDA、GSH含量、线粒体ROS荧光强度、GPX4、SLC7A11、TFRC的mRNA水平和蛋白表达量的差异，采用细胞划痕、细胞管形成实验检测各组细胞迁移率和血管分支数的变化情况。 结果: 1本试验共纳入104例，其中治疗组52例，对照组52例。两组患者一般资料组间均衡，具有可比性。治疗组治疗8周后临床痊愈9例（17.31％）、显效28例（53.85％）、有效15例（28.84％）;对照组临床痊愈6例（11.54％）、显效19例（36.54％）、有效27例（51.92％），治疗组临床疗效优于对照组（P＜0.05）。治疗组治疗8周后创面面积较对照组缩小更明显（P＜0.05）。治疗组治疗8周后DMIST量表评分低于对照组，局部创面情况改善更明显（P＜0.05）。两组患者创面肉芽组织MDA和GSH含量差值比较，治疗组较对照组MDA含量降低更显著，GSH含量升高更显著。治疗组治疗后患者创面组织GPX4、SLC7A11、VEGF阳性表达升高，TFRC阳性表达降低。两组患者治疗前后肝肾功能无明显差异，无不良反应发生。 2干预后第1、3、7、14天，四组小鼠创面愈合形态、愈合率（愈合速度）、愈合情况（HE、Masson染色）比较，非糖尿病溃疡小鼠均优于糖尿病溃疡小鼠，DUZ组和DUB组干预后均优于DU组。干预后第3天，与NU组比较，DU组创面组织线粒体超微形态结构的变化符合典型的铁死亡电镜下表现，而DUZ组线粒体的铁死亡形态改变较DU组有所改善。干预后第14天，DU组较NU组创面组织MDA含量升高、GSH含量降低，DUZ组、DUB组干预后较DU组MDA含量降低、GSH含量升高。干预后第14天，DU组较NU组创面组织GPX4、SLC7A11和VEGFA mRNA水平和蛋白表达量降低，TFRC mRNA水平和蛋白表达量升高。DUZ组和DUB组干预后GPX4、SLC7A11和VEGFA mRNA水平和蛋白表达量升高，TFRC mRNA水平和蛋白表达量降低。 3在高糖下RSL-3诱导的血管内皮细胞（HUVEC细胞）铁死亡模型中，与Control组比较，glucose组和RSL-3+glucose组细胞内Fe2+和MDA含量、线粒体ROS荧光强度升高，GSH含量、细胞迁移率、血管分支数降低，GPX4、SLC7A11 mRNA水平和蛋白表达量降低，TFRC mRNA水平和蛋白表达量升高。与RSL-3+glucose组比较，紫朱软膏醇提物和Fer-1分别加入干预后，细胞内Fe2+和MDA含量、线粒体ROS荧光强度降低，GSH含量、细胞迁移率、血管分支数升高，GPX4、SLC7A11 mRNA水平和蛋白表达量升高，TFRC mRNA水平和蛋白表达量降低。 结论: 1紫朱软膏适合糖尿病足溃疡全程治疗，能改善DMIST量表评分、提高机体的抗氧化能力、降低体内脂质过氧化水平、诱导血管新生，对创面愈合过程中铁死亡相关指标有一定调节作用。 2紫朱软膏能够促进糖尿病溃疡小鼠溃疡创面愈合;紫朱软膏醇提物能够抑制高糖下RSL-3诱导的血管内皮细胞铁死亡，加强细胞迁移增殖能力。紫朱软膏的治疗作用机制可能是通过抑制组织细胞铁死亡从而诱导机体组织新生，改善创面局部氧化应激微环境，促进糖尿病创面修复。
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