摘要
非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属唯一的大DNA病毒，主要依靠蜱和节肢动物在家猪和野猪之间传播。目前基于主要衣壳蛋白p72以及基于病毒血凝素CD2样蛋白(CD2v)和C型凝集素将ASFV划分为24个基因型和8种血清型。但是，对ASFV的有效防控截至目前仍然没有成功。这是由于病毒的复杂性以及我们对ASFV毒力因子和免疫相关性的了解有限。因此，ASFV对全球养猪业构成重大威胁，对ASFV疫苗的需求是当务之急。 我们首先对CD2v蛋白糖基化展开了研究:通过质谱技术鉴定了外囊膜蛋白CD2v的糖基化修饰位点和糖肽，共计6个N-糖位点和11个O-糖位点在CD2v胞外域被筛选到，糖链类型以高甘露糖型和杂合型为主。在不同N糖突变体表达蛋白迁移实验中，N117位点突变几乎不影响蛋白质迁移速率，N133点突变不影响蛋白表达量，而N144突变基本检测不到目的蛋白表达，其余N糖位点突变也均对CD2v表达和成熟有一定的影响。除此之外，N糖基化位点突变也影响蛋白质在胞质内转运，所有N糖突变都导致表达蛋白完全呈现典型的ER染色模式，除N133位点之外，其余位点突变导致表达蛋白完全不能靶向高尔基体。序列分析结果过显示，N133和N144位点属于所有血清型均保守存在的糖基化位点。意外的是，糖修饰对于蛋白与红细胞结合能力没有影响。 我们又进一步研究了 ASFV多组分亚单位疫苗:利用293真核表达系统成功表达融合细胞因子重组蛋白IFN-CD2v-Fc、IL2-P54-Fc、P12-Fc和原核蛋白P72-IFN。以多组分混合方式肌注免疫后，免疫血清可产生针对IFN-CD2v-Fc和P72-IFN的总IgG滴度。虽然IL2-P54-Fc和P12-Fc未产生特异性免疫血清，但是ELISPOT结果表明多组分亚单位疫苗可分别产生针对4种组分的细胞免疫应答反应。遗憾的是，免疫血清产生的抗体滴度均不能中和ASFV在体外对猪原代巨噬细胞的感染，而且具有一定的ADE作用。 随后，本文聚焦于另外一种依赖虫媒传播的RNA病毒，登革病毒(Dengue virus,DENV),按血清型将DENV划分为4种。全世界每年约有4亿例登革热病例和22,000例死亡，对公共卫生安全极具威胁性。原发性感染会激活针对特定DENV血清型的免疫反应，但二次感染异源血清型以及抗体依赖性增强(Antibody dependent enhancement,ADE),导致感染后疾病的严重程度会增强。目前，在临床评估中取得最大进展的DENV疫苗包括TAK-003(DENVax;Takeda)和TV003 (NIAID/NIH),但是因减毒的活疫苗的安全系数较低。仅CYD-TDV四价减毒活疫苗经FDA获批可在感染过DENV的群体中使用。相比较于传统疫苗，新型mRNA载体疫苗平台的发展，为DENV的防控带来了更多的机遇与希望。 本章节中，我们通过多序列比对、分析，设计编码嵌合DENV-1/4的囊膜蛋白 Ⅲ 结构域(Envelope，E-DⅢ)和 DENV-2/3 的非结构蛋白 1 (Nonstructural protein 1,NS1)的mRNA疫苗，并利用纳米脂质体颗粒递送系统完成小鼠体内免疫。结果表明，单剂量5μg免疫3次，DENV-a(E1+NS1-2)和DENV-b(E4+NS1-3)免疫血清具有较高的抗体滴度(The endpoint titer＞105)和病毒中和滴度(102-104)。同时，血清ELISA和活化T细胞ELISPOT试验证实两款mRNA疫苗均是偏向Th1的细胞免疫反应。另外，与对照组相比，攻毒后免疫组小鼠体内病毒血症清除较快，而且不会出现典型的血浆渗漏。体外细胞ADE试验证实，嵌合NS1基因不会明显诱导免疫血清对异源DENV的增强作用。以上结果说明，两款mRNA疫苗均可以在体内诱导广谱、长效的体液和细胞免疫应答反应，嵌合NS的多靶标mRNA疫苗可能作为未来DENV疫苗设计的主要方向。
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