摘要
目的: 肛瘘（Anal Fistula，AF）主要以瘘道外口持续性或间断性出现脓性、血性或黏液性分泌物以及局部的红、肿、热、痛为临床表现，其术后许多并发症同样困扰大多数患者。随着生物信息学在医学研究领域中的盛行，从基因角度出发探讨肛瘘的发病机制研究是不可或缺的。本研究通过利用高通量转录组测序技术，筛选出与湿热下注型肛瘘发病密切相关的信号通路及核心致病基因，并通过临床和基础实验探究黄连解毒汤对湿热下注型肛瘘的干预效应及疗效机制，期望为有关肛瘘的临床研究提供理论依据。 方法: 1.纳入2023年5月至7月在肛肠科入院并符合湿热下注型肛瘘诊断的患者4例，术中采集患者肛瘘组织为病理组织，正常粘膜组织为对照，对8例样本进行高通量转录组测序。利用edgeR软件包对测序数据进行匹配，并进行差异表达基因的分析。为了深入理解这些差异表达基因的功能和参与的通路，进一步运用Metascape平台进行基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。为筛选出湿热下注型肛瘘致病相关的核心基因，在STRING平台和Cytoscape 3.8.2软件中，对富集到的基因进行了进一步的分析和筛选。最后对差异基因行GSEA富集分析，并与PPI网络筛选出的基因相交得到关键基因。 2.纳入2023年9月至2024年1月在肛肠科入院符合湿热下注型肛瘘诊断的患者，共计40例。随机分组后，中药组于术前2周给予口服黄连解毒汤后行肛瘘切除术，对照组仅行肛瘘切除术，术中采集两组患者肛瘘病理组织。术后对比中药组和对照组的临床观察指标，包括临床疗效评价、术后创面疼痛（VAS）评分和术后创面愈合时间，以评定黄连解毒汤对于湿热下注型肛瘘患者的术后疗效、术后疼痛和创面愈合情况。采用RT-PCR以验证致病基因在中药组和正常组mRNA的表达水平。HE染色和Masson染色法观察显微镜下肛瘘病理组织形态改变。测量对比两组患者血清炎症因子水平。 结果: 1.高通量转录组测序筛选湿热下注型肛瘘发病相关的核心信号通路及关键基因 筛选得到湿热下注型肛瘘与瘘管旁正常粘膜组织差异表达基因2859个，其中1109个上调基因，1750个下调基因。进一步GO富集分析揭示了 6283条生物学过程、639条细胞组分和1161条分子功能相关条目。KEGG信号通路富集分析获得与湿热下注型肛瘘相关联的通路348条，如蛋白质消化吸收、钙信号通路、ECM-受体相互作用、cGMP-PKG信号通路等多条通路。进一步鉴定出CDC42、CD44、MYC、FN1、NUSAP1、PBK、CDC45、RACGAP1、MCM10、CDC20十个湿热下注型肛瘘核心致病基因。通过GSEA富集分析验证，其中心肌收缩、运动蛋白、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路、细胞周期通路富集最明显，且参与该通路的基因有CDC20。 2.黄连解毒汤对湿热下注型肛瘘的治疗效应与干预机制 （1）两组患者性别、年龄、身高、体重、体质指数、吸烟史、饮酒史、住院时间差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 （2）两组患者临床疗效比较有统计学意义（P=0.029＜0.05），中药组总有效率95.0％,对照组总有效率85.0％，中药组疗效更好。 （3）两组患者术后6h、3d、7d创面疼痛差值差异具有统计学意义（F组内=180.150,P＜0.001,F 组内*组间=12.950,P=0.037,F 组间=15.307,P＜0.001），随着时间推移中药组较对照组疼痛缓解更快。 （4）两组患者术后创面愈合时间差异无统计学意义（P=0.593＞0.05），中药组平均愈合（43.65±8.09）天，对照组平均愈合时间（44.95±7.13）天，中药组与对照组愈合时间相近。 （5）两组患者肛瘘组织RT-qPCR检测结果显示，与对照组相比中药组CDC20、MYC、CD44水平呈低表达。 （6）HE染色组织病理学检查结果显示，中药组皮肤恢复情况更为良好，局部损伤处表皮有所修复，有一定厚度，真皮层结缔组织排列紧密、有序，且可见新生的毛囊和皮脂腺，未见炎细胞浸润。 （7）免疫组化检查结果显示与对照组相比，中药组肛瘘组织中CDC20蛋白呈低表达。 （8）两组患者的IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-α水平差异均无统计学意义（P＞0.05）;两组患者的IL-6、IL-8水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）,中药组IL-6、IL-8水平低于对照组。 结论: 1.基于高通量转录组测序技术筛选出与湿热下注型肛瘘发病密切相关的蛋白质消化吸收、钙信号通路、ECM-受体相互作用、cGMP-PKG信号通路等多条通路，进一步鉴定出 CDC42、CD44、MYC、FN1、NUSAP1、PBK、CDC45、RACGAP1、MCM10、CDC20十个湿热下注型肛瘘核心致病基因。通过GSEA富集分析验证并与PPI网络筛选出的基因相交，最后筛选出CDC20为关键致病基因。 2.黄连解毒汤可改善肛瘘患者术后疗效，减轻术后疼痛，促进创面愈合，抑制多种炎症因子的释放，下调CDC20基因表达。
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