摘要
研究目的: 胆汁淤积是指胆汁流形成、分泌或排泄障碍引起的一种病理状态，持续胆汁淤积可导致胆汁淤积性肝纤维化(Cholestatic liver fibrosis，CLF),针对CLF,目前有效治疗药物仍非常匮乏，亟需探索新的治疗策略。胆汁淤积属中医“黄疸”范畴，黄疸根据病程和症状分为阳黄和阴黄，阴黄证常见于慢性胆汁淤积。茵陈术附汤(YinchenzhufuDecoction,YCZFD)是中医治疗阴黄证的代表方，临床常用于多种胆汁淤积性肝病的治疗。我们前期研究显示，YCZFD具有抗慢性胆汁淤积作用，但YCZFD是否具有抗CLF作用及作用机制尚不清楚。由于组学技术可以从系统水平探索中药复方的复杂机制，本研究运用定量蛋白质组学和磷酸化修饰组学技术，探究YCZFD干预对1，4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二乙酯(3,5-Dicarbethoxy-1,4-dihydrocollidine,DDC)诱导的小鼠CLF的作用及作用机制，采用分子生物学方法对关键通路进行验证，以期阐明YCZFD抗CLF的作用及作用机理，为YCZFD防治CLF的临床应用及复方中药新药研发提供基础。 研究方法: 1.采用DDC饲料诱导的CLF小鼠模型，分别给予YCZFD高剂量(YCZFD-H)和YCZFD低剂量(YCZFD-L)干预，每天给药1次，连续给药4周，4周后检测小鼠血生化、肝脏病理形态学、肝脏胶原沉积、胶原表达(α-平滑肌肌动蛋白，胶原蛋白Ⅰ)，评价茵陈术附汤干预对DDC诱导的小鼠CLF的作用。 2.采用定量蛋白质组学技术，分析YCZFD干预对CLF小鼠肝组织蛋白质组的影响，从整体水平上探究YCZFD干预对DDC诱导的CLF小鼠肝脏蛋白质组的作用，分析关键差异蛋白和信号通路。 3.采用磷酸化修饰组学技术，探究YCZFD干预对DDC诱导的CLF小鼠肝脏蛋白质磷酸化水平的影响，分析YCZFD干预对CLF小鼠肝组织中磷酸化修饰谱和信号通路的调控作用。 4.联合分析定量蛋白质组和磷酸化修饰组结果，解析YCZFD改善小鼠CLF的关键生物学过程，运用RT-qPCR、Westernb Blot、流式细胞术等技术与方法，对关键分子通路进行验证。 5.在多组学研究结果及前期药代动力学研究基础上，以核心蛋白PDGFRβ为研究目标，采用实时荧光定量PCR、分子对接技术，探究YCZFD作用PDGFRβ的关键成分，初步探究YCFD抗CLF的有效成分群。 结果: 1.与正常组小鼠相比，DDC诱导的CLF小鼠血生化指标ALT、AST、TBA、DBIL和TBIL显著升高，肝组织胆管卟啉沉积、炎症细胞浸润和肝细胞坏死明显;肝组织中肝纤维化相关蛋白CLO1A1、α-SMA等纤维化指标表达显著升高，经YCZFD干预后，CLF小鼠血生化指标ALT和AST水平明显降低，肝组织损伤显著减轻，肝脏纤维化蛋白表达显著降低，研究结果证实YCZFD具有抗CLF作用。 2.定量蛋白质组学研究结果发现，经YCZFD干预后，CLF小鼠肝脏中共有291个差异蛋白经YCZFD干预后得以有效逆转，功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络分析结果显示，这些差异蛋白主要富集于PI3K-AKT通路、黏着斑、ECM-受体生物学过程，血小板衍生生长因子受体(Platelet-Derived Growth Factor Receptor,PDGFRβ)处于这些相互作用网络的重要节点位置，推测PDGFRβ可能是YCZFD发挥抗CLF的关键效应蛋白。 3.磷酸化修饰组学分析发现，YCZFD干预对CLF小鼠肝脏中黏着斑、黏附连接、自噬、PPAR等多个生物学过程或信号通路有显著影响，YCZFD干预可以逆转CLF小鼠肝脏中黏着斑通路中PDGFRβ/PI3K下游分子磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(Phosphoinositide Dependent Protein Kinase 1，PDPK1)磷酸化水平的升高。 4.蛋白组学及磷酸化蛋白组学研究结果联合分析显示，经典方YCZFD可能通过调控PDGFRβ/PI3K/AKT发挥抗CLF的作用，分子生物学实验也证明YCZFD可以通过调控PDGFRβ/PI3K/AKT通路，抑制肝星状细胞的活化和增殖，改善CLF。 5.以核心蛋白PDGFRβ为目标，采用RT-qPCR实验方法，发现YCZFD中多个成分如甘草次酸、白术内酯Ⅰ、芒柄花素、滨蒿内酯等可下调PDGFRβ表达。分子对接和细胞热迁移结果显示，甘草次酸与PDGFRβ具有较好的结合活性。 结论: 1.经典方茵陈术附汤具有改善CLF作用。 2.定量蛋白质组学及磷酸化修饰组学研究发现茵陈术附汤可能通过调控PDGFRβ/PI3K/AKT通路，抑制肝星状细胞活化和增殖改善CLF。 3.茵陈术附汤中甘草次酸等多种成分参与调控PDGFRβ。
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