摘要
β-葡萄糖苷酶(Beta-glucosidase)能特异性地水解纤维二糖及纤维寡糖的β-1,4-糖苷键，是纤维素降解、食品增香、糖基化合物合成等过程中的关键酶。β-葡萄糖苷酶因酶活低、热稳定性差等因素限制其工业应用，使得寻找高酶活、高热稳定性的β-葡萄糖苷酶具有重要意义。目前，通过高通量测序、基因注释、克隆β-葡萄糖苷酶基因，并异源表达获得β-葡萄糖苷酶的方式更加快速、精准。 本论文根据芒草驯养牛瘤胃微生物的宏基因组数据，基于生物信息学分析和基因克隆技术，获得了一条编码 β-葡萄糖苷酶的基因Bgls3,并通过重组原核表达Bgls3蛋白，系统研究了 Bgls3的酶学特性，借助同源建模、分子对接、分子动力学方法分析了 Bgls3蛋白结构与功能的关系，通过定点突变技术改造β-葡萄糖苷酶Bgls3的热稳定性，为工业化应用奠定基础。主要研究结果如下: (1)克隆获得的β-葡萄糖苷酶基因Bgls3的开放阅读框长度为2340 bp,编码779个氨基酸;Bgls3基因所编码的蛋白分子量为85.27 kDa,包含一个GH3保守结构域,是稳定的亲水性蛋白，属于糖苷水解酶家族3。 (2)构建了重组表达载体pET30a(+)-Bgls3,并转入BL21大肠杆菌中诱导获得了高效表达的重组β-葡萄糖苷酶。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物，测得Bgls3酶的最适反应温度为45℃，最适pH为5.5,该条件下的酶活为306.2 U/mg。该酶在低温下稳定性好，在50℃保温5 min失去了 60％以上酶活，当保温至30 min时，仅残余3％的酶活力，热稳定性差。 (3)构建了 Bgls3与底物pNPG的对接模型，底物pNPG结合在Bgls3蛋白区域Ⅰ和蛋白区域Ⅱ连接的口袋位置，与D88、K193等氨基酸有直接的氢键作用，E294、Y240、R160、W273、S395、E486、H194 等对 pNPG 的识别也有贡献。 (4)通过定点突变获得了 E75A、Q128K、D306E、K337Q、N358A、I375V、R377S、Q408E等热稳定性提升的突变体。它们在50℃保温5 min后的残余酶活力分别为:77％、84％、56％、73％、56％、38％、75％、54％;保温 30 min 后残余酶活力分别为:32％、26％、31％、23％、21％、10％、23％、19％，相较于野生型，热稳定性均有所提高。
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